文庫定量試劑盒（illumina的品牌是百奧萊博，是優(yōu)質(zhì)的核酸擴增(PCR)產(chǎn)品，本制品用于科研目的，我公司的文庫定量試劑盒（illumina品質(zhì)上佳，經(jīng)過多年的開發(fā)生產(chǎn)，已然非常成熟，歡迎廣大新老客戶訂購。

北京百奧萊博科技有限公司是一家專業(yè)的生物試劑銷售公司。公司主要經(jīng)營血清、抗原、抗體等生物試劑產(chǎn)品，可以為您提供專業(yè)的技術服務，以優(yōu)良的價格、優(yōu)質(zhì)的服務、優(yōu)先的理念，滿足客戶的各方面的需求，與國內(nèi)多家企業(yè)、單位建立了良好的長期合作關系，擁有較好的企業(yè)信譽和品牌形象。

特別提示：包括文庫定量試劑盒（illumina)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：文庫定量試劑盒（illumina)
英文名稱：DNA Quantification Kit（illumina)
產(chǎn)品貨號：WH0205
產(chǎn)品規(guī)格：500×20μl

本試劑盒是通過SYBR Green I嵌合熒光qPCR法進行Illumina平臺下高通量測序文庫濃度測定的專用試劑盒。具體的工作原理是以Illumina P5和P7芯片結(jié)合序列為引物，利用試劑盒提供的6個標準品繪制標準曲線，再根據(jù)標準曲線通過定量法來計算待測文庫的濃度。

本試劑盒提供了文庫定量所需的所有組分，其中的2×Quant MasterMix （SYBR Green)采用了抗體修飾的熱啟動型Taq DNA聚合酶，配合添加了H-compete因子和EP組分的qPCR Buffer體系，使得qPCR預混液具有廣泛的樣本普適性，同時還具有擴增效率高，檢測特異性好、GC含量適應性廣、檢測靈敏度高等特點，zuì大程度的保障了文庫濃度定量的準確性和重復性。

試劑盒中提供的標準品共分為6個梯度，覆蓋區(qū)間為20 pM~0.0002 pM，梯度間的濃度差別為10倍，標準品為線性雙鏈DNA片段，片段大小為449 bp，GC含量為51.2%。

試劑盒中提供的10×qPCR Primer Mix中的引物是根據(jù)Illumina P5和P7芯片結(jié)合序所設計，包括如下兩種引物：
Primer 1：5"-AATGATACGGCGACCACCGA-3"；
Primer 2：5"-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3"。

同時，試劑盒還提供了用于文庫樣品稀釋的10×Library Dilution Buffer，方便客戶對文庫樣品進行定量前的稀釋。此外，本試劑盒不但可用于文庫樣品的定量，還可用于檢測實驗環(huán)境中文庫污染的程度。

產(chǎn)品特點：
·簡便快速：試劑盒提供了用于文庫定量的所有試劑，操作簡便快速，與上游建庫試劑盒兼容性好；
·定量準確：檢測試劑擴增效率高，特異性好，在0.0002 pM～20 pM范圍內(nèi)均有很好的線性關系；
·適應廣泛：試劑盒提供的qPCR試劑具有良好的GC含量和擴增片段大小普適性。

試劑盒組成：

組分	規(guī)格
2×Quant MasterMix （SYBR Green)	4×1.25ml
10×Library Dilution Buffer	2×1 ml
10×qPCR Primer Mix	1 ml
DNA Standard 1（20 pM)	100μl
DNA Standard 2（2 pM)	100μl
DNA Standard 3（0.2 pM)	100μl
DNA Standard 4（0.02 pM)	100μl
DNA Standard 5（0.002 pM)	100μl
DNA Standard 6（0.0002 pM)	100μl
50×ROX Reference Dye	1 ml
Nuclease-Free ddH2O	5×1ml

保存條件：收到本產(chǎn)品后，請立即置于-20℃避光保存。從-20℃取出使用時，將凍存的組分融解，然后輕輕顛倒混勻，待溶液完全均一后再行使用。如解凍后沒有使用，須徹底混勻后重新冷凍。（在解凍過程中鹽會出現(xiàn)分層現(xiàn)象，未混勻進行冷凍，鹽晶體的析出將會對酶造成損害)。如需一段時間內(nèi)經(jīng)常取用，可在2~8℃條件下儲存3個月。避免反復多次凍融。

注意事項：（請務必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項）
1．關于移液
①所有試劑在使用前需解凍充分，震蕩混勻并短暫離心收集液體后再開蓋使用；
②盡量避免使用排槍，盡量使用帶濾芯的槍頭。
2．1×Library Dilution Buffer的準備
用無核酸酶污染的超純水或者分子生物學級別的水來稀釋Library Dilution Buffer，不要用DEPC處理的水或自來水來稀釋?？筛鶕?jù)實際用量選擇Library Dilution Buffer的稀釋量，1×Library Dilution Buffer可在2-8℃條件下保存6個月。
3．文庫的濃度和稀釋度
文庫必須稀釋至標準曲線有效CT值范圍內(nèi)才能進行定量分析。計算濃度時，有效CT值范圍之外的CT值不可用于計算。若文庫只有一個稀釋度，則需重新稀釋至合適濃度后再次進行定量；若文庫有多個稀釋梯度，則可選取落在有效范圍內(nèi)的CT值進行濃度計算。標準曲線有效CT值范圍選取方案參見“數(shù)據(jù)分析部分”。文庫稀釋可參照過往經(jīng)驗或使用其他測定方式測定的濃度作為參考進行。下表為可定量文庫濃度范圍：

濃度類型	有效范圍
摩爾濃度	20 pM～0.0002 pM
質(zhì)量濃度	5.93pg/μl～5.93×10-5pg/μl
拷貝數(shù)濃度	1.20×107copys/μl～1.20×102copys/μl

4．文庫的稀釋
利用準備好的1×Library Dilution Buffer對文庫樣品進行稀釋，請勿使用水作為稀釋液。高濃度DNA溶液粘稠，DNA分散度較差，要避免直接進行大體積稀釋（比如一次性稀釋10,000倍)，推薦進行多次小體積稀釋。比如：若需要對文庫進行10,000倍稀釋，則可將文庫進行兩次100倍的連續(xù)稀釋。文庫應該現(xiàn)用現(xiàn)稀釋，用完丟棄。qPCR反應之前，應將稀釋后的文庫和解凍后的DNA Standards置于冰上存放。
5．污染預防與無模板陰性對照（NTC，No Template Control）
①為防止PCR產(chǎn)物污染造成定量結(jié)果不準確、可信度不高等問題，推薦將反應體系配制區(qū)和模板制備區(qū)進行物理隔離、使用專用的移液器等設備、使用帶濾芯的槍頭、并定時對各實驗區(qū)域進行清潔。
②反應體系配制過程中DNA Standards和不同稀釋度文庫樣品的加入應按照從低濃度至高濃度的順序進行，并且每次移液都應更換新的槍頭，以避免氣溶膠污染。
③每次實驗都應進行NTC陰性對照反應，并結(jié)合熔解曲線進行擴增特異性和體系污染程度分析。由于檢測引物為P5/P7相關的通用引物而非特異引物，且反復進行文庫稀釋和定量時的氣溶膠污染無法完全避免，因此NTC反應出現(xiàn)擴增并且產(chǎn)生CT值應屬正常情況。數(shù)據(jù)分析時，可先根據(jù)NTC起峰情況確定標準曲線有效CT值范圍（方案參見“數(shù)據(jù)分析部分”)，再進行標準曲線繪制和文庫濃度計算。
6．擴增曲線基線設置
由于標準品1的濃度遠高于常規(guī)qPCR模板，其CT值會非常?。ㄒ话銥?~9)。而大部分qPCR儀器都會默認將3~15循環(huán)設置為基線，因此有時會造成標準品1的CT值錯誤，進而影響標準曲線的線性關系。手動設置基線為1~3循環(huán)可以有效避免這種情況的發(fā)生。
7．文庫分子長度校正
熒光染料SYBR Green I結(jié)合DNA后產(chǎn)生的熒光強度與DNA分子量成正比。例如：兩個
300 bp的雙鏈DNA分子產(chǎn)生的熒光強度與一個600 bp的雙鏈DNA分子產(chǎn)生的熒光強度相當。因此，在進行文庫濃度定量時，必須根據(jù)標準品DNA的長度（449 bp)和文庫平均長度對文庫摩爾濃度進行長度矯正（方案參見“數(shù)據(jù)分析部分”)。
8．熔解曲線分析
熔解曲線在判斷擴增特異性、污染程度分析以及確認標準曲線zuì大有效CT值時至關重要，因此建議客戶每次實驗都應進行熔解曲線采集步驟。DNA標準品產(chǎn)生的熔解曲線呈現(xiàn)特征雙峰（下圖紫色箭頭標記)，這種情況是DNA標準品的不同位置在不同溫度下解鏈而造成，并不是非特異性擴增產(chǎn)物。此外，前3個DNA標準品的濃度高，循環(huán)結(jié)束時擴增產(chǎn)物過多，會導致部分產(chǎn)物在Tm值附近無法完全解鏈。因此，前3個DNA標準品產(chǎn)生的熔解曲線有時會出現(xiàn)翹尾現(xiàn)象（下圖紅色箭頭標記)，屬正常情況。
9．其他定量方法的關系
高通量測序文庫有多種濃度測定方式，如光譜測定法（NanoDropTM等)、熒光染料法（Qubit?、PicoGreen?等)、電泳檢測法（2100 Bioanalyzer、TapeStation、LabChip? GX等)、
qPCR檢測法等。其中，qPCR檢測法因只測定可擴增文庫（雙端接頭完整)，因此測定值與真實值zuì接近。一般來說，qPCR法測定的文庫濃度會比其他方法略低一些，可使用其他方法粗略測定的文庫濃度作為參考，選取合適的文庫稀釋度進行qPCR法濃度測定。然而，當文庫被過度擴增時（如擴增循環(huán)數(shù)太多)，也會導致qPCR法測定的文庫濃度比其他方法高一些（非特異性擴增產(chǎn)物的干擾）。此時，若使用其他方法粗略測定的文庫濃度作為稀釋參考，會出現(xiàn)文庫稀釋度不足的情況。

一、操作步驟：
1．準備適量1×Library Dilution Buffer （參見注意事項中“1×Library Dilution Buffer的準備”部分)。1×Library Dilution Buffer可在2~8℃條件下保存6個月，用完后放回2~8℃條件下保存。
2．使用1×Library Dilution Buffer將待測文庫進行適度稀釋。文庫濃度不同，zuì佳稀釋倍數(shù)也不盡相同。推薦稀釋度為1/1,000~1/100,000，并至少設置一個額外的2倍稀釋，如1/10,000和1/20,000。文庫應現(xiàn)用現(xiàn)稀釋，稀釋后置于冰上備用，用完丟棄。
3．將2×Quant MasterMix （SYBR Green)、10×qPCR Primer Mix、50×ROX Dye （如需要)、DNA Standard 1~6和RNase-Free ddH2O解凍，解凍后上下顛倒充分混勻，并短暫離心將溶液收集至管底，置于冰上備用。用完后立即放回-20℃保存。
4．按下表體系進行qPCR反應體系配制：

成分	20μl體系	終濃度
2×Quant MasterMix （SYBR Green)	10μl	1×
10×qPCR Primer Mix	2μl	1×
DNA Standard 1~6或稀釋后的文庫或滅菌蒸餾水	4μl	-
50×ROX Reference Dye△1	-	-
Nuclease-Free ddH2O△2	至20μl	-

注意：△1幾種常見儀器的zuì適ROX Reference Dye濃度見下表：

儀器	濃度
ABI PRISM 7000/7300/7700/7900HT/StepOne等	2×（例如：5 μl ROX/20 μl體系)
ABI 7500、7500 Fast、ViiA 7； Stratagene Mx3000P、Mx3005P和Mx4000等	1×（例如：0.4 μl ROX/20 μl體系)
Roche儀器，Bio-Rad儀器，Eppendorf儀器等	無需添加

注意：△2推薦進行20 μl反應。如需進行10 μl反應，可將體系各組分等比減少即可。
5．按下表體系進行qPCR反應程序設置：

階段	循環(huán)	溫度	時間	內(nèi)容	熒光信號采集
預變性	1×	95℃	5min	預變性	否
PCR反應	35×	95℃	30sec	變性	否
		60℃	45sec△3	退火/延伸	是
熔解曲線分析（Melting/Dissociation Curve Stage）

注意：△3若文庫平均長度超過600 bp，應將退火延伸時間由45 sec延長至90 sec。

二、數(shù)據(jù)分析
1．標準曲線制作
根據(jù)復孔間CT值差異≤0.2的原則，對DNA Standards原始CT值進行篩選，并計算平均CT值。CT值篩選過程中，若其中兩個復孔的CT值比較接近，并且與第三個復孔之間的CT值差異較大，那么可刪除第三個復孔的數(shù)據(jù)，使用前兩個復孔的CT值計算平均CT值。若三個復孔之間的CT值差異均超過0.2，則需重復實驗。
2．根據(jù)NTC的CT值確認標準曲線CT值的有效范圍
可根據(jù)下表內(nèi)容判斷標準曲線CT值的有效范圍，其中S1-6代表DNA Standard 1~6：

NTC的CT值	zuì大有效CT值	CT可用的標準品梯度
CT（NTC)>CT（S6)+3	CT（S6)	S1-6
CT（S6)+3>CT（NTC)>CT（S5)+3	CT（S5)	S1-5
CT（S5)+3>CT（NTC)>CT（S4)+3	CT（S4)	S1-4
CT（S4)+3>CT（NTC)>CT（S3)+3	體系存在污染，需更換體系重復實驗

3．繪制標準曲線
使用有效范圍內(nèi)DNA標準品的CT值（作為縱坐標)和對應DNA標準品濃度的Log值（作為橫坐標)繪制標準曲線。繪制的標準曲線相關系數(shù)中，R2應不低于0.99，斜率應位于-3.1~-3.6之間（表示擴增效率位于90%~110%之間)。如標準曲線參數(shù)不佳，應重復試驗。

三、文庫濃度計算
1．根據(jù)復孔間CT值差異≤0.2的原則，對文庫原始CT值進行篩選，并計算平均CT值。CT值篩選過程中，若其中兩個復孔的CT值比較接近，并且與第三個復孔之間的CT值差異較大，那么可刪除第  三個復孔的數(shù)據(jù)，使用前兩個復孔的CT值計算平均CT值。若三個復孔之間的CT值差異均超過0.2，則需重復實驗。
2．根據(jù)標準曲線計算稀釋文庫的濃度（pM)。
  稀釋文庫的CT值只有位于標準曲線有效CT值范圍之內(nèi)才可用于濃度計算。請勿使用標準曲線有效CT值范圍之外的CT值計算稀釋文庫的濃度。
3．根據(jù)下述公式對稀釋文庫的濃度（pM)進行長度矯正。
  矯正后的稀釋文庫濃度（pM) =[449 bp/文庫平均長度（bp)]×稀釋文庫的濃度（pM)
4．根據(jù)下述公式計算原始文庫濃度（nM)。
  原始文庫濃度（nM) =矯正后的稀釋文庫濃度（pM)×稀釋倍數(shù)/1,000

四、參考實例
1．初始材料
  利用BaiSeq DirectFast DNA Library Prep Kit （illumina) （WH0203)制備的三個插入長度約300 bp的DNA文庫（文庫總長度~420 bp)。經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100 High Sensitivity DNA Assay檢測獲得文庫的長度、濃度。具體信息見后續(xù)數(shù)據(jù)分析表。
2．文庫稀釋與標準曲線的繪制
  將三個文庫分別用制備好的1×Library Dilution Buffer進行1/10,000稀釋（兩次1/100)和1/20,000稀釋（1/10,000稀釋產(chǎn)物再稀釋一倍)。
  qPCR反應結(jié)束后，經(jīng)過對DNA Standards原始CT值的篩選和標準曲線CT值有效范圍的確定，進而繪制DNA標準品的標準曲線，具體數(shù)據(jù)和篩選過程如下表所示：

DNA Standard	Log[pM]	CT值			平均CT值	△CT值*1
1	Log[20]	8.98	9.00	8.95	8.98	－
2	Log[2]	12.43	12.40	12.45	12.43	3.45
3	Log[0.2]	15.87	15.90	15.92	15.9	3.47
4	Log[0.02]	19.36	19.34	19.38	19.36	3.46
5	Log[0.002]	22.78	22.77	22.69	22.75	3.39
6	Log[0.0002]	26.09	26.07	26.33*2	26.08	3.33
NTC	-	32.04	32.1	32.03	32.05	－

注意*1：10倍梯度稀釋的標準品，△CT值應處于3.1～3.6之間。
注意*2：根據(jù)復孔間CT值差異≤0.2的原則，刪掉該數(shù)據(jù)。

根據(jù)上表中的數(shù)據(jù)，繪制的標準曲線如下圖所示：


3．文庫稀釋與標準曲線的繪制
qPCR反應結(jié)束后，經(jīng)過對待測樣品CT值數(shù)據(jù)的篩選后，將合理數(shù)據(jù)代入到標準曲線中計算待測文庫的濃度，具體數(shù)據(jù)、篩選過程和計算過程如下表所示：

注意*：根據(jù)復孔間CT值差異≤0.2的原則，刪掉這兩個數(shù)據(jù)。
   至此，使用本產(chǎn)品用于文庫濃度測定的計算過程已完成?？蛻艨筛鶕?jù)上述參考實例來進行實驗過程中文庫濃度的測定。

常見問題及解決辦法：

現(xiàn)象	原因分析及解決辦法
擴增效率超出 90%~110%范圍	若NTC與6號標準品的ΔCT值小于3或者5、6號兩個標準品的ΔCT值小于3.1，且計算擴增效率超過，那么應是反應體系有污染?？筛鶕?jù)NTC陰性對照的熔解曲線確認污染源（文庫污染或DNA Standards污染)。繪制標準曲線時，應先根據(jù)NTC的CT值確定標準曲線有效CT值范圍，舍棄受污染影響的標準品，使用剩余的有效標準品繪制標準曲線。
	不恰當?shù)幕€（baseline)設置會增大DNA Standard 1的CT值，進而影響擴增效率計算。手動調(diào)整基線（baseline)為1-3循環(huán)，可解決此問題。
	移液不準確。
R2＜0.99	移液不準確。
	所有試劑在使用前應充分解凍并徹底混勻。
	儀器相關問題。確認所用ROX Reference Dye與定量儀器匹配。
標準品擴增 曲線分布不均一	若5、6兩個標準品的ΔCT值小于3.1，那么應是反應體系有污染。可根據(jù)NTC陰性對照的熔解曲線確認污染源（文庫污染或DNA Standards污染)。
	若1、2兩個標準品的ΔCT值小于3.1，那么應是基線（baseline)設置不當。手動調(diào)整基線（baseline)為1~3。
	若DNA Standards之間的ΔCT值大于3.6，那么提示擴增效率差。確認所有試劑在使用前都已充分解凍并徹底混勻；確認所有組分濃度正確以及反應程序無誤。
	長時間強光照射會導致2×Quant MasterMix （SYBR Green)熒光下降，進而造成ΔCT大于3.6。應按照推薦方式避光貯存試劑。
復孔重復性差	移液不準確。
	所有試劑在使用前應充分解凍并徹底混勻。
	儀器相關問題。確認所用ROX Reference Dye與定量儀器匹配。
待測文庫各稀釋度 的ΔCT值與稀釋 倍數(shù)差異不一致	移液不準確。
	所有試劑在使用前應充分解凍并徹底混勻。
	文庫難于擴增。GC/AT含量過高或長度超過1 kb的文庫擴增效率較差，定量波動性大。
	文庫降解。文庫應現(xiàn)用現(xiàn)稀釋，稀釋好的文庫應置于冰上備用，用完丟棄。
文庫各稀釋度計算 的初始文庫濃度 差異超過10%	移液不準確。
	所有試劑在使用前應充分解凍并徹底混勻。
	文庫難于擴增。GC/AT含量過高或長度超過1 kb的文庫擴增效率較差，定量波動性大。
	文庫降解。文庫應現(xiàn)用現(xiàn)稀釋，稀釋好的文庫應置于冰上備用，用完丟棄。
稀釋文庫CT值超 過標準曲線有效 CT值范圍	若稀釋文庫的CT值小于1號標準品的CT值，那么提示文庫稀釋度不夠，多見于過度擴增的文庫。提高文庫稀釋倍數(shù)重復實驗。
	若稀釋文庫的CT值大于6號標準品的CT值，那么提示文庫稀釋度過高或構建失敗。常規(guī)文庫在1/10,000左右的稀釋度時得到的CT值是不會超過6號標準品的CT值的。減少稀釋倍數(shù)重復實驗。
1號標準品的CT值 異常	不恰當?shù)幕€（baseline)設置會增大DNA Standard 1的CT值，進而影響擴增效率計算。手動調(diào)整基線（baseline)為1~3循環(huán)，可解決此問題。
DNA Standards有 擴增，而文庫沒有 擴增或者CT值很大	文庫接頭序列錯誤，建議核對文庫末端序列與試劑盒提供的引物序列是否匹配。
	稀釋度過高，建議減少稀釋倍數(shù)，重復實驗。
	文庫降解，文庫應現(xiàn)用現(xiàn)稀釋，稀釋好的文庫應置于冰上備用，用完丟棄。

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YT376 PCR Buffer套裝(用于PCR優(yōu)化) 5ml
YT384 PCR Master Mix (含桔色電泳染料) 400次|2000次10000次
YT399 礦物油(石蠟油) 20ml
WE0115 尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶) 200U|1000U

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名稱：PCR級綠如藍DNA染料
貨號：BTN70909
規(guī)格：0.1mL
第二代的非飽和型熒光染料(如SYBR Green I)在高濃度下會抑制熒光PCR，所以反應重復性很不穩(wěn)定，并且不能用于要求嚴格的Tm分析。本產(chǎn)品跟SYTO9、LC Green、EvaGreen一樣，是第三代飽和型熒光染料，在飽和濃度下也不抑制熒光PCR反應。

產(chǎn)品特點：
1. 飽和濃度不抑制PCR反應，因此得到的熒光信號更強。
2. 抗水解、抗熱解和抗光解的能力強于目前zuì常用的SYBR Green I。
3. 飽和濃度下染料分子沒有機會在DNA分子間發(fā)生移位，因此熒光強度跟DNA變性程度呈線性關系，可以用于精細的Tm 測定實驗，如High-resolution melting curve analysis等。
4.跟目前常用的PCR 儀器(包括iCycler、LightCycler、ABI 測序儀)兼容。激發(fā)和發(fā)射光譜跟FAM和SYBR Green I 接近，可以使用SYBR Green I的光學設置參數(shù)。
5. 不能滲透進入細胞內(nèi)，毒性和致突變性遠低于SYBR Green I。
6.可以用于qPCR、高分辨DNA 溶解曲線分析(HRM、high-resolution DNA melt curve analysis)、毛細管電泳等研究。

儲存條件：常溫運輸、-20℃避光保存，有效期一年。

使用方法：
先將本產(chǎn)品放置在室溫融化，然后震蕩10秒鐘，短暫離心后待用。下面以50μL的標準PCR反應體系為例說明其使用：

1.在一干凈的PCR 管中，加入下列成分：

試劑	加入量
10×PCR Buffer(No Mg2+)	5μl
MgCl2 50mM	2.5μl
dNTP 10mM	1μl
本產(chǎn)品(PCR級綠如藍染料)	2.5μl
Taq DNA聚合酶	1-5U
DNA模板	適量
PCR引物	5-50 pmol each
補水到	50μl

2. 放入熒光PCR 儀中進行qPCR，并在退火或延長反應時記錄熒光信號。使用的光學參數(shù)可以跟FAM或SYBR Green I 完全一樣。

注意事項：
1. 如果使用iCycler，可以不加FAM；如果使用ABI系統(tǒng)，需要在Well Inspector選項下的非特異參照中選擇“無”；使用LightCycler時，zuì好在PCR 體系中再加入終濃度為0.5mg/mL的BSA以降低儀器對染料和模板的非特異吸附。
2. 如果使用化學修飾過的Taq DNA聚合酶，可能需要減低KCl的濃度并提高Tris的濃度。

本頁產(chǎn)品地址：http://m.521uz.com/sell/show-8529343.html