一步法反轉(zhuǎn)錄-熒光定量試劑盒

  本制品是采用SYBR Green I嵌合熒光法進(jìn)行Real Time One Step RT-qPCR的專用試劑。使用本制品進(jìn)行Real Time One Step RT-qPCR反應(yīng)可在同一反應(yīng)管內(nèi)連續(xù)進(jìn)行，操作簡(jiǎn)單，避免了樣品間交叉污染的同時(shí)也提高了檢測(cè)的靈敏度。

  本試劑盒中的25×RT-PCR Enzyme Mix為TIANGEN新型逆轉(zhuǎn)錄酶(FastKing RTase)、新型抗體修飾熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶和RNase Inhibitor的預(yù)混Mix形式，其中的FastKingRTase，是分子改造后的新型逆轉(zhuǎn)錄酶，特別增加了疏水motif，具有強(qiáng)的RNA親和性和熱穩(wěn)定性，提高了該酶的逆轉(zhuǎn)錄效率和對(duì)具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)RNA模板的延伸能力;PCR過程中采用了性能優(yōu)良的新型熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶，使得逆轉(zhuǎn)錄后的PCR反應(yīng)具高的擴(kuò)增效率和特異性。另外，本產(chǎn)品中的2×FastKing RT-qPCR Buffer (SYBR Green)是專門為上述兩種關(guān)鍵酶而優(yōu)化的新型反應(yīng)體系，其中包含必要離子組分、dNTPs、SYBR Green染料以及One Step 穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑，可保證FastKing RTase和新型熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶在整個(gè)一步法反應(yīng)過程中發(fā)揮優(yōu)良功效。

  本制品可以在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)得到良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)多種高低豐度的靶基因進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測(cè)，重復(fù)性好，可信度高。

  產(chǎn)品特點(diǎn)：

  提高反應(yīng)效率：性能優(yōu)良的逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶保證了高的反應(yīng)效率;

  操作簡(jiǎn)單快速：雙組分的產(chǎn)品形式使得操作過程變得簡(jiǎn)單快速;

  通讀復(fù)雜模板：能夠作用于GC含量高，二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的RNA模板;

  樣品普適性高：對(duì)不同物種來源及雜質(zhì)較多的RNA模板的適用性高。

  用戶自己需要準(zhǔn)備的

  1. 引物;

  2. 模板;

  3.一次性手套及其它耗材;

  適用范圍

  RT-qPCR技術(shù)可用于檢測(cè)細(xì)胞和組織中的基因表達(dá)水平及RNA病毒的含量。

  操作步驟

  1. 完全融化模板RNA，特異性引物，2×FastKing RT-qPCR Buffer (SYBR Green)，50×ROX Reference Dye和RNase-Free ddH2O，短暫離心后置于冰浴上。

  2. 按下表在冰浴條件下配制反應(yīng)液：

  組成成分 體積/反應(yīng)

  2×FastKing RT-qPCR Buffer (SYBR Green) 25 μl

  25×RT-PCR Enzyme Mix 2 μl

  上游特異性引物(10 μM) 1.25 μl*1

  下游特異性引物(10 μM) 1.25 μl*1

  RNA模板 10 pg-1 μg total RNA

  50×ROX Reference Dye*2 根據(jù)不同儀器添加

  RNase-Free ddH2O 補(bǔ)水至50 μl

  總體系 50 μl

  *1 引物終濃度為0.25 μM可以在大多數(shù)體系中獲得良好的擴(kuò)增結(jié)果。擴(kuò)增效率不高時(shí)，可增加PCR反應(yīng)體系中的引物濃度;發(fā)生非特異擴(kuò)增時(shí)，可適當(dāng)減少PCR反應(yīng)體系中的引物濃度。需要進(jìn)一步優(yōu)化引物濃度的，可以在0.05-0.90 μM范圍內(nèi)調(diào)整。

  *2 幾種常見儀器的匹配ROX Reference Dye濃度見下表：

  儀器 終濃度

  ABI 5700/7000/7HT/StepOneTM/

  StepOne PlusTM

  5×(例如：5 μl ROX/50 μl體系)

  ABI 7500、7500 Fast、ViiA 7、QuantStudio 、

  12K Flex;Agilent Mx3000P、Mx3005P和Mx4000 1×(例如：1 μl ROX/50 μl體系)

  Roche儀器，Bio-Rad儀器，Eppendorf儀器等 不用添加

  3. 進(jìn)行Real Time One Step RT-qPCR反應(yīng)

  PCR反應(yīng)管請(qǐng)用離心機(jī)瞬時(shí)離心后放入熒光定量PCR儀中進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)。建議采用下列圖表顯示的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)程序，如果使用該程序得不到良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，再進(jìn)行PCR條件的優(yōu)化。

  注意事項(xiàng)

  1. RNA 模板可以采用總RNA 或mRNA，建議使用TIANGEN公司生產(chǎn)的TRNzol，RNAprepPure或RNA Easy Fast系列制備高質(zhì)量的總RNA。

  2. 一步法RT-qPCR實(shí)驗(yàn)應(yīng)避免RNase污染，可采用以下措施：

  1) 因人的皮膚表面和唾液都有RNase，因此實(shí)驗(yàn)中應(yīng)佩戴一次性手套和口罩;

  2) 一步法RT-qPCR實(shí)驗(yàn)應(yīng)使用專門的儀器和耗材，建議在專門區(qū)域操作RNA;

  3) 一步法RT-qPCR實(shí)驗(yàn)相關(guān)耗材應(yīng)用0.1% DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃處理12 h，并高壓滅菌30 min后使用。

  3. 25×RT-PCR Enzyme Mix在取用之前應(yīng)短暫離心收集溶液后再吸取，吸取時(shí)動(dòng)作要慢，使用后應(yīng)盡快放回-20℃。

  4. 2×FastKing RT-qPCR Buffer (SYBR Green)在取用前應(yīng)充分混勻并離心后使用。

  熒光定量試劑盒上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵(lì)志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠(yuǎn)銷多個(gè)國家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準(zhǔn)則、以市場(chǎng)需求為導(dǎo)向，不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。古朵試劑盒