特別提示:包括6nt隨機(jī)引物(0.5 ug/uL)在內(nèi),本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn),嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途!
產(chǎn)品名稱:6nt隨機(jī)引物(0.5 ug/uL)
英文名稱:Hexamer
產(chǎn)品貨號(hào):BTN100409
產(chǎn)品規(guī)格:5μg
本產(chǎn)品為長(zhǎng)度為6nt的隨機(jī)引物,序列為5′-(NNNNNN)-3′,主要用于以任何RNA為模板合成cDNA,也可以用于DNA探針的隨機(jī)引物標(biāo)計(jì)。
儲(chǔ)存條件:低溫運(yùn)輸和-20℃保存,有效期一年。
疑難解答:
Q:在合成cDNA時(shí),使用Oligo dT12-18和用隨機(jī)引物有何區(qū)別?
A:只有當(dāng)以帶polyA尾巴的RNA作為模板才能使用Oligo dT作為引物,而任何RNA模板都可以使用隨機(jī)引物。使用后者的序列覆蓋率比使用Oligo dT更高。
根據(jù)您的關(guān)注的
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BTN60804 PCR抑制物清除劑 1mL
BTN131141 dNTP和引物清除劑 100次
BTN130957 免RNA提取RT-PCR試劑盒(細(xì)胞組織裂解物RT-PCR試劑盒) 100次
YT374 DNA聚合酶(高保真)(率)(雙平端克隆) 200U|1000U
YT377 富含GC PCR Buffer 2ml
YT397 cDNA鏈合成試劑盒II(RNase H-) 20次|100次
WE0139 一步法Real-Time RT-qPCR試劑盒(高含量ROX校正染料) 100次
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關(guān)注
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名稱:2%明膠溶液(PCR級(jí))
貨號(hào):BTN70905
規(guī)格:1.5mL
大量實(shí)驗(yàn)顯示一定比例的明膠能夠促進(jìn)PCR反應(yīng)。本產(chǎn)品為2%的明膠溶液,按1/5到1/20(具體取決于PCR反應(yīng)體系)的比例加入到PCR反應(yīng)體系中,可以提高PCR的效率。
儲(chǔ)存條件:低溫運(yùn)輸、-20℃保存,有效期一年。
名稱:即用型易錯(cuò)PCR試劑盒
貨號(hào):BTN101005
規(guī)格:100次
本產(chǎn)品就是專門(mén)為廣大的研究工作者進(jìn)行易錯(cuò)PCR而開(kāi)發(fā)。易錯(cuò)PCR是利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校對(duì)功能的特性,在一定條件下(如不同的dNTP濃度、Mg濃度和MnCl2存在)能夠按較高的機(jī)率引入隨機(jī)引入突變。如果有適當(dāng)?shù)倪x擇方法,則可從構(gòu)建的突變庫(kù)選出所需突變體。
產(chǎn)品特點(diǎn):
1. 即開(kāi)即用,十分簡(jiǎn)單方便,尤其在生物制藥和酶學(xué)研究領(lǐng)域顯示出了它的優(yōu)越性。
2. 配方經(jīng)過(guò)精心優(yōu)化,突變率穩(wěn)定,突變沒(méi)有趨向性。易錯(cuò)PCR的突變率為0.66%(±0.13%),詳見(jiàn)使用手冊(cè)疑難解答。
3. 比體內(nèi)基因突變更快捷簡(jiǎn)單,但如果在PCR引物中設(shè)計(jì)位點(diǎn),則可使產(chǎn)物克隆到表達(dá)載體,也可以用于體內(nèi)蛋白活性的篩選。
4.可用于連續(xù)易錯(cuò)PCR,只需把上一次易錯(cuò)PCR的產(chǎn)物用作下一次易錯(cuò)PCR的模板即可,使每一次獲得的小突變累積而產(chǎn)生重要的有益突變。
5. 只適用于擴(kuò)增1kb以下的產(chǎn)物,對(duì)于1kb以上的產(chǎn)物,建議分段擴(kuò)增。
試劑盒組成:
成分
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規(guī)格
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Taq DNA聚合酶(5U/μL)
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100μl
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易錯(cuò)PCR Mix,10×
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300μl
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易錯(cuò)PCR專用dNTP,10×
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300μl
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MnCl2,5mM
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300μl
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說(shuō)明書(shū)
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1份
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儲(chǔ)存條件:低溫運(yùn)輸,-20℃保存,有效期為一年。
使用方法:
1.以30μL的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系為例,如果反應(yīng)體系不是30μL,各成分需要等按比例增加或減少。在一干凈的PCR管中,加入下列成分:
易錯(cuò)PCR Mix,10×
|
3μl
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易錯(cuò)PCR 專用dNTP,10×
|
3μl
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MnCl2,5mM
|
3μl
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自備DNA模板(10ng/μL)
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1μl
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PCR引物(自備,10μm each)
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10pmol each
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Taq DNA聚合酶(5U/μL)
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1-5U
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補(bǔ)水到
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30μl
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2. 按已經(jīng)優(yōu)化的PCR條件進(jìn)行一定循環(huán)數(shù)的PCR(循環(huán)數(shù)與突變率的關(guān)系見(jiàn)下表),然后取5μL電泳檢查。如果沒(méi)有優(yōu)化的PCR條件,一般可以先嘗試下面的PCR條件:
PCR前變性
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94℃ 3分鐘
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易錯(cuò)PCR
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94℃ 1分鐘
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循環(huán)30次(見(jiàn)注)
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45℃ 1分鐘
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72℃ 1分鐘
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注:易錯(cuò)PCR一般不需要熱啟動(dòng),也不需要在PCR結(jié)束后做延伸處理。
循環(huán)次數(shù)與突變幾率的關(guān)系
易錯(cuò)PCR循環(huán)次數(shù)決定每個(gè)核苷酸位置的突變幾率,進(jìn)而決定每個(gè)PCR產(chǎn)物可能得突變位點(diǎn)數(shù),所以所需循環(huán)數(shù)由客戶根據(jù)需要改動(dòng)。
PCR循環(huán)數(shù)
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每個(gè)堿基突變幾率
|
PCR終產(chǎn)物中的突變位點(diǎn)數(shù)
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100bp
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200bp
|
400bp
|
800bp
|
1600bp
|
5
|
0.0033
|
0.00
|
0.66
|
1.3
|
2.6
|
5.3
|
10
|
0.0066
|
0.66
|
1.3
|
2.6
|
5.3
|
11
|
20
|
0.013
|
1.3
|
2.6
|
5.3
|
11
|
21
|
30
|
0.020
|
2.0
|
4.0
|
7.9
|
16
|
32
|
50
|
0.033
|
3.3
|
6.6
|
13
|
26
|
53
|
3.電泳檢測(cè)是否得到預(yù)計(jì)長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物。
疑難解答:
Q:易錯(cuò)PCR與定點(diǎn)突變PCR有什么區(qū)別?
A:定點(diǎn)突變是指通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因組,也可以是質(zhì)粒)中引入所需變化(通常是表征有利方向的變化),包括堿基的添加、刪除、點(diǎn)突變等。它需要預(yù)先知道靶基因的序列。易錯(cuò)PCR是一種隨機(jī)突變,它不需要預(yù)先知道靶基因的序列(引物結(jié)合部分除外),但需要后續(xù)的篩選方法篩選自己所需要的突變。
Q:易錯(cuò)PCR的錯(cuò)誤率是多少?
A:易錯(cuò)PCR的突變率為0.66%(±0.13%),對(duì)500bp的PCR產(chǎn)物,相當(dāng)于有4%的PCR片段為野生型,12%的含一個(gè)突變,20%的含兩個(gè)突變,22%的含三個(gè)突變,18%的含四個(gè)突變,12%的含五個(gè)突變,12%的含六個(gè)或更多突變。
Q:如果需要每個(gè)核苷酸有高于0.66%的突變率,如何辦?
A:可以使用連續(xù)多次易錯(cuò)PCR來(lái)提高突變率。但zuì好先用膠純化回收PCR片段,再用于下一輪PCR。此外不能用少于千分之一的次PCR產(chǎn)物作為第二輪易錯(cuò)PCR的模板,否則多樣性將受到影響。第三輪易錯(cuò)PCRzuì好使用所有第二輪的PCR產(chǎn)物作為模板,但需要在10mL體系中完成(可以分成很多100μL體系進(jìn)行)。
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