梯度PCR儀設計引物應遵循哪些原則
發布時間：2017-08-07瀏覽次數：1725返回列表
導讀：梯度PCR儀因為被擴增的不同DNA片段，其適退火溫度事不同，通過設置一系列的梯度退火溫度進行擴增，從而一次性PCR擴增，就可以篩選出表達量高的適退火溫度，進行有效的擴增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴增，這樣節約成本的同時也節約了時間。主要用于科研，教學機構。梯度PCR儀，在不設置梯度的情況下也可以做普通PCR擴增。
梯度PCR儀使用注意事項
1、 制備測序模板：PCR儀擴增的產物可以經過低熔點的瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，用于序列分析；可經過柱層析純化，去除PCR儀反應后剩余的dNTP和引物后，用于序列分析。PCR儀產物也可不經純化直接用于測序，但是這種測序產生的結果較差，建議測序之前應進行PCR產物的純化。各種標準的質粒制備方法所純化出的質粒均可作為測序模板使用。用標準方法制備的M13噬菌體、粘粒、λDNA都適合用作測序模板用。但要注意的是反應體系中不應有與引物互補的非目的基因序列，否則將會導致測序實驗的失敗。
2、 測序引物：測序引物是指合成的與測序模板鏈特異性互補的寡核苷酸序列。可用α-32P-dATP和T4多聚核苷酸激酶對引物的5‘端進行標記，反應體系中引物、激酶和α-32P-dATP要保持在佳的比例，以得到高比活性的標記引物；也可用α-32P-dATP標記新合成的DNA鏈。引物的濃度不宜高，否則容易形成引物二聚體，或產生非特異性的擴增引物。
3、 酶：各種缺乏3‘—5‘端外切活性的耐熱DNA聚合酶都可以用于循環測序，其中TaqDNA聚合酶在DNA測序中為常用。雖然應用PCR循環測序法能夠簡單、快速的進行基因序列的測定，但仍未能適應大規模DNA序列測定的需要，而PCR循環測序法、熒光標記和自動測序儀的聯合使用成為大規模基因組測序的主要技術。該技術是采用熒光標記引物或雙脫氧核苷三磷酸，反應產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳后，經特定的DNA序列分析儀和分析系統處理待測的DNA序列。它的應用減輕了DNA序列測定的工作量，提高了測序的效率。
梯度PCR儀設計引物應遵循以下原則：
①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3’端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。
⑤引物3’端的堿基，特別是末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。
