普通PCR和熒光定量PCR引物設計區別
發布時間：2024-05-13瀏覽次數：826返回列表
普通PCR和熒光定量PCR引物設計區別：
一、方法不同
1、普通pcr引物設計：引物的優劣直接關系到PCR的特異性與成功與否。
2、熒光定量pcr引物設計：通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，標記跟蹤PCR產物進行實時監測反應，利用與之相適應的軟件對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度
二、原理不同
1、普通pcr引物設計：為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。
2、熒光定量pcr引物設計：在PCR反應體系中加入熒光基團，通過熒光信號不斷累積而實現實時監測PCR全程，然后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在實時熒光定量PCR中，對全程PCR擴增過程進行實時檢測，根據反應時間和熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。
三、注意事項不同
1、普通pcr引物設計：引物應用核酸系列保守區內設計并具有特異性。產物不能形成二級結構。引物長度在15~30堿基之間。
1、熒光定量pcr引物設計：實時熒光定量 PCR 儀應安放在濕度較低、灰塵較少、遠離水池的平穩臺面上，不能有強光直射，室內應通風良好，無腐蝕性氣體 。
假陽性是指出現的 PCR 擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶整齊，亮度高。
產生的原因有：
①引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行 PCR 擴增時，擴增出的 PCR 產物為非目的序列；
②靶序列太短或引物太短；
③靶序列或擴增產物的交叉污染。
解決方法有：操作輕柔，防止靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外造成污染；除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材高壓消毒；離心管及加樣槍頭等一次性使用。必要時，可在加標本前，將反應管和試劑用紫外光照射，以破壞存在的核酸。
單克隆抗體的特性：
1.高度特異性；
2.高度的均一性和可重復性；
3.弱凝集反應和不呈現沉淀反應；
4.對環境敏感性 單克隆抗體越純 ，對溫度越敏感，對pH越敏感。低濃度的NaCl 對單克隆抗體有一定的保護作用。
