REAGEN? 氯霉素酶聯免疫反應測試盒說明書

RND99001

1．概述

REAGEN?氯霉素ELISA試劑盒酶聯免疫反應測試盒利用競爭性酶聯免疫反應原理，對魚、蝦、肉（牛肉、雞肉、豬肉）、雞蛋、蜂蜜、煉奶、牛奶、奶粉等中氯霉素的殘留進行定量檢測。檢測肉樣時此試劑盒提取方法也可選擇與AOZ、AMOZ、SEM、AHD的五合一前處理方法統一處理一個樣品，而同時檢測幾個項目。該試劑盒有以下特點：

? 高回收率(80-115%以上)，快速(10-40分鐘之內完成提取過程)低成本提取。

? 檢測限0.05ng/g 。

? 檢測過程只需要不到1小時。

? 高重復性。

? 五合一處理方法更省時、經濟、環保。

2．氯霉素ELISA試劑盒原理

REAGEN?氯霉素酶聯免疫反應測試盒基于競爭性酶聯反應原理，將氯霉素的蛋白偶聯物包被于微孔板上。藥物分析時，樣品、酶標二抗以及氯霉素抗體都被加入到微孔中，如果樣品中含有CAP，會競爭CAP抗體，抑制酶標板上的氯霉素與氯霉素抗體結合，同時酶標二抗與氯霉素抗體結合型成符合物。加入底物后，產物的顏色強弱與樣品中CAP的濃度成反比。

3. 氯霉素ELISA試劑盒組成

已包被抗體的酶標板(CAP-coated Plate)（可拆式）............. 12×8 孔

標準液(Standards)（0，0.05，0.15，0.5，1.5，4.5ppb） 6×1.0mL

回收用10ppb(Spiking)（可選） 1×1.0ml

CAP 一抗(Antibody #1) 1×6mL

酶標二抗(HRP Conjugated Antibody #2) 1×6mL

10×樣品提取液(Sample Extraction Buffer) 1×25mL

20×濃縮洗液(Wash Solution) 1×30mL

終止液(Stop Buffer) 1×12mL

TMB底物(TMB Substrate)      1×12mL

本試劑盒應當在2-8℃的溫度下儲存，有效期為一年。如果超過3個月不使用試劑盒，

請將一抗和酶標二抗放置-20℃或者冰凍保存。

4.檢測定量限

5.交叉反應：

6．未提供的設備或材料

1) 酶標儀

2) 恒溫培養箱

3) 移液器(10、20和100mL，1mL各一支)

4) 氮吹儀

5) 漩渦振蕩器

6) 勻質器

7) 多道移液器（50-300mL）

8) 乙酸乙酯

9) 正己烷

7.注意事項

實驗前請閱讀以下文字，以保證獲得最佳實驗效果。

1) 標準品中含有氯霉素，請小心使用。

2) 不要使用過期的試劑盒。

3) 不同批次的試劑盒不要混用，抗體和微孔板具有盒與批次的特異性。

4) 盡量保持室溫20-25℃，避免在通風口操作防止溫度過低，過熱和/或者蒸發。同樣的，不要在陽光直射下實驗，防止過熱及蒸發。在孵育期間，如果工作臺溫度過低，應該鋪墊若干紙巾或者其他物料。

5) 水質量很重要，確保使用蒸餾或者去離子水。

6) 加入樣品或者試劑到空的微孔板時，吸嘴靠于微孔接近底部，并保持接觸。

7) 孵育時間的計算越規范越好，保持添加標準品的一致性，先添加標準品后添加樣品。

8) 從低濃度到高濃度地添加標準品，降低影響標準品曲線質量的風險。

9) 將微孔板置于放有干燥劑的密封袋中，冷藏保存。

8．試劑的準備

所有的試劑在使用之前應將其回溫至室溫，并在使用試劑前搖動幾下，以保證合理的濃度。

（1）1×工作洗液

按1：19的比例配制濃縮洗液和蒸餾水。舉例：取10ml的20X濃縮洗液加入到190ml雙蒸餾水中，配制成200ml的1X工作洗液，按需要，可同比例放大或縮小。

（2）1×樣品提取液

按1：9的比例配制樣品提取濃縮液和蒸餾水。舉例：取1ml的10X樣品提取液加入到9ml雙蒸餾水中，配制成10ml的1X樣品提取液，按需要，可同比例放大或縮小。

9．樣品的準備

1） 魚/蝦/肉（牛肉/雞肉/豬肉）/雞蛋

（1） 取適量樣品用勻漿器勻漿；

（2） 稱3g的勻質樣品加6mL乙酸乙酯，以最大轉速渦旋振蕩3分鐘；

（3） 室溫（22.5±2.5）°C下離心力4000g離心5分鐘；

（4） 移取4mL乙酸乙酯上清液（相當于2g原始樣品），在60-70 ℃下減壓蒸餾

或者60-70 ℃水浴氮氣吹干；

（5） 加入2mL 正己烷溶解干燥物；

（6） 加入1mL的1×樣品提取液，最大轉速渦旋振蕩2分鐘；

室溫（22.5±2.5）°C下離心力4000g離心10分鐘，去除上層正己烷層；

（7） 每孔取50μL下層液，進行樣品測試。

稀釋倍數：0.5

魚/蝦/肉（牛肉/雞肉/豬肉）五合一前處理方法：

（1） 使用適當勻漿器勻漿樣品；

（2） 稱取1g勻質樣品加入0.5mL1×樣品提取液，3.5mL蒸餾水，0.5mL 1M HCl和20μL50 mM 2-硝基苯甲醛，渦旋震蕩30秒；

（3） 50°C恒溫培養3小時，培養期間，每小時振蕩5秒；（說明書后**標記方法可供選擇）

（4） 加入5mL 0.1 M K₂HPO₄，0.4 mL 1 M NaOH， 6 mL 乙酸乙酯，渦旋震蕩振蕩5分鐘；

（5） 室溫（22.5±2.5）°C下離心力4000g離心10分鐘；

（6） 取3mL上清液(包含0.5g的原始樣品)到另一試管（避免觸及下層水相！如果移取液中

含有水相，再次4000g離心5分鐘，取上層有機相），如果出現乳化現象，上清液不足3mL，請85℃水浴3分鐘。在60 -70°C減壓蒸餾或60-70°C氮氣吹干；

（7） 用1 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥好的樣品；（注：由于肝臟組織富含脂肪、色素等，為防止乳化現象發生，建議選用4mL正己烷溶解，渦旋震蕩30秒后，再進行下一步操作）

（8） 加入1mL1×樣品提取液，劇烈振蕩2分鐘；

（9） 室溫（22.5±2.5）°C下離心力4000g離心10分鐘；

（10） 每孔取50μL下清液，進行樣品測試。

稀釋倍數：2

2） 蜂蜜

（1） 稱2g蜂蜜樣品，加入4mL蒸餾水于一離心管中；

（2） 加入4mL乙酸乙酯，以最大轉速渦旋振蕩3分鐘；

（3） 室溫（22.5±2.5）°C下離心力4000g離心5分鐘；

（4） 取1mL上清液（相當于0.5g原始樣品），60-70℃水浴減壓蒸餾干燥，或者在60-70 ℃水浴氮氣吹干；

（5）   用2 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥好的樣品；

（6）   加入0.5mL1×樣品提取液溶解干燥物，最大速度渦旋振蕩2分鐘；

（7）   室溫（22.5±2.5）°C下離心力4000g離心10分鐘；

（8） 每孔取50 μL下清液，進行樣品測試。

稀釋倍數：1.0

3) 煉奶

（1） 稱取1g樣本，加入1mL水，渦旋振蕩混勻后再加入6mL乙酸乙酯，渦旋振蕩3分鐘；

（2） 室溫（22.5±2.5）°C下離心力4000g離心5分鐘；

（3） 移取3mL上層溶液（相當于0.5g樣本）到另一試管，60-70℃水浴減壓蒸餾，或者在60-70 ℃水浴氮氣吹干；

（4） 用2 mL 正己烷(或者正庚烷)溶解干燥好的樣品；

（5）   加入0.5mL1×樣品提取液溶解干燥物，最大速度渦旋振蕩2分鐘；

（6）   室溫（22.5±2.5）°C下離心力4000g離心10分鐘；

（7） 每孔取50 μL下清液，進行樣品測試。

稀釋倍數：1.0

4） 牛奶

（1） 取1mL牛奶樣品，加入5mL乙酸乙酯溶液，最大速度渦旋振蕩3分鐘；

（2） 室溫（22.5±2.5）°C下離心力4000g離心5分鐘；

（3） 移取2.5mL上層液到另一試管，60-70℃水浴減壓蒸餾，或者在60-70 ℃水浴氮氣吹干；

（4） 加入2.0mL正己烷和0.5mL1×樣品提取液，最大速度渦旋振蕩2分鐘溶解干燥物；

（5） 室溫（22.5±2.5）°C下離心力4000g離心2分鐘；

（6） 去除上層正己烷層，每孔取50 μL下清液進行測試。

稀釋倍數：1.0

5） 奶粉

（1） 稱取2g奶粉，加入10mL蒸餾水溶解，混合均勻；

（2） 室溫（22.5±2.5）°C下離心力4000g離心5分鐘，除去上層脂肪層；

（3） 從水相中取4mL下清液，加入6mL乙酸乙酯，最大速度渦旋振蕩3分鐘；

（4） 室溫（22.5±2.5）°C下離心力4000g離心5分鐘；

（5） 移取3mL上層溶液（相當于0.4g原始奶粉）到另一試管，60-70℃水浴減壓蒸餾，或者在60-70 ℃水浴氮氣吹干；

（6） 加入0.8mL1×樣品提取液溶解干燥物；

（7） 每孔取50 μL上清液，進行樣品測試。

稀釋倍數：2.0

10．檢測步驟

以下為計算份量的表格，用戶可根據自己的需要來確定需要配置多少試劑。

（1） 加入50mL的標準液于所設定的孔中；

（2） 加入50mL的樣品于所設定的孔中；

（3） 在每孔中加入50mL酶標二抗；

（4） 在每孔中加入50mL抗體， 輕敲微孔板邊緣混勻30秒；

（5） 室溫（22.5±2.5）°C避光孵育30分鐘；

（6） 洗板4次，每次加入250mL 1×洗液，最后一次盡量甩干并在吸水紙上吸干；

（7） 每孔加入100mL的TMB底物，用手敲板邊緣1分鐘混合均勻；

（8） 室溫（22.5±2.5）°C避光孵育15分鐘， 加入100mL的終止液終止反應；

（9） 在450nm下讀OD值(讀數前，用無絨布擦拭除去微孔底部的水分和指痕)。

11．結果計算

1. 以標準品的濃度和平均相對吸光值分對數為橫縱坐標做對數標準曲線

2. 相對吸光值（%）=標準品（或樣品）吸光值/零標準吸光值×100

3. 根據樣品的平均吸光值分對數在標準曲線上確定對應的濃度（通用計算軟件根據Log/Log 標曲看線性和結果）。

備注：如結果呈陽性反應，應該用其他檢驗方法（如色譜/質譜方法等）進行確證。

以下曲線圖是氯霉素酶聯免疫反應測試盒典型標準曲線