ELISA試劑盒 "一"問"一"答——樣本篇

  問：我能否不用推薦的收集方法來收集血漿?

  答：每一次按照推薦步驟操作的測定都是經(jīng)過驗(yàn)證可行的。在某些測定中有些抗凝劑是不被推薦的。具體請參看說明書。

  有些待檢測的分析物也存在于血小板中，因此，推薦使用低血小板血漿。正確的收集操作方法請參看說明書。

  問：我是否可以將試劑盒中說明書的樣品數(shù)據(jù)作為參考?

  答：說明書中的樣品數(shù)據(jù)是從有限的檢測個(gè)體中得出，只能作為大概的指導(dǎo)。

  問：我能否使用自己的稀釋液或者緩沖液?

  答：每個(gè)試劑盒中都含有按配方配制的與特異性樣品種屬相配套的稀釋液，以確保待檢測的樣品被正確稀釋。

  每個(gè)試劑盒中都含有按配方配制的與特異性樣品種屬相配套的稀釋液，以確保待檢測的樣品被正確稀釋。

  問：我是否必需按照試劑盒內(nèi)說明書中的方法準(zhǔn)備樣品?

  答：推薦的樣品準(zhǔn)備方法是經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的佳的方法，所以推薦按照說明書上的方法制備樣品。

  問：我使用對照的檢測結(jié)果都在范圍外，為什么?

  答：如果使用對照，其濃度應(yīng)該是在某一特定范圍內(nèi)。如果對照值在范圍外，則是無效測定。確定對照具有重復(fù)性。

  問：我沒有足量的稀釋液去稀釋所有的樣品，怎么辦?

  答：試劑盒內(nèi)提供說明書中所的足量的稀釋液。能保證所有的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品檢測兩次。

  如果沒有推薦的稀釋度，或者需要大量稀釋，請?jiān)趯?shí)驗(yàn)前計(jì)算出所需的稀釋液總量，然后聯(lián)系我們獲取額外的稀釋液。

  問：我是否可以省略說明書中標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品值?

  答：不可以。樣品值必需由每次檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線決定。

  問： 如果是手繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，我怎樣決定樣品濃度?

  答：要決定每個(gè)樣品的濃度，首先找到Y(jié)軸的光度值或者相對光單位，然后作水平線至標(biāo)準(zhǔn)曲線。在交點(diǎn)處，作垂線至X軸，讀取相應(yīng)濃度。

  問： 我檢測到的樣品值在測定實(shí)驗(yàn)的動(dòng)態(tài)范圍之外，我是否可以用這些數(shù)值?

  答：只有隨標(biāo)準(zhǔn)曲線降低的樣品值才被推薦使用。在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍外的值都是非線性的，會導(dǎo)致錯(cuò)誤的外推值。

  如果測定的樣品值比高的標(biāo)準(zhǔn)品的值還要高，則此樣品需要進(jìn)一步的稀釋并重新進(jìn)行檢測。

  如果測定的樣品值遠(yuǎn)低于測定范圍，則樣品被認(rèn)為是無法被檢測。

  問：我的樣本經(jīng)不同梯度稀釋，計(jì)算得到的樣本濃度差異較大

  答：血清樣本加樣量較高時(shí)，血清中的各種蛋白會抑制抗原抗體接觸，稀釋后，干擾蛋白也稀釋，影響較小。當(dāng)某兩個(gè)梯度稀釋后，計(jì)算得出的樣本濃度接近時(shí)，則認(rèn)為該稀釋梯度時(shí)，樣本值接近真實(shí)值。

  問：標(biāo)曲和樣本都顯色，但復(fù)孔的CV大

  答：這個(gè)問題就跟移液器和實(shí)驗(yàn)者的操作有關(guān)了。移液器的使用維護(hù)不規(guī)范，就會造成移液的誤差較大;實(shí)驗(yàn)者自身的操作習(xí)慣、加樣的一致性對復(fù)孔的CV也有很大影響。

  掌握移液器的正確使用和維護(hù)。關(guān)于個(gè)人的操作可練習(xí)移液動(dòng)作、加快速度，確保移液的度。

  問：我的本底偏高，樣本值測不到

  答：標(biāo)曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(對于高敏ELISA可以適當(dāng)放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時(shí)候，本底過高會掩蓋目的信號，導(dǎo)致無法測到樣本值。

  在加入TMB顯色后，需實(shí)時(shí)觀察標(biāo)曲顯色情況。通常在S5孔有肉眼可見的微弱藍(lán)色，即可終止反應(yīng)。

  問：我的標(biāo)曲和樣本均不顯色

  答：在孵育階段靜置在桌面上，這樣非常不利于抗原抗體之間的充分接觸，導(dǎo)致顯色偏弱。

  推薦孵育階段，使用ELISA專用的微孔板振蕩器，調(diào)至合適的頻率，使抗原抗體充分接觸，保證結(jié)合效果。如果排除上述原因，有可能是漏加了某個(gè)組分，如檢測抗體、酶等。對于比較馬虎的新手，一定要做好標(biāo)記和記錄，或者使用添加染料的ELISA試劑盒。

  問：我的標(biāo)準(zhǔn)曲線看上去還不錯(cuò)，但是卻沒有達(dá)到我預(yù)期的結(jié)果，為什么?

  答: 樣品可能不含有待分析物。稀釋液的影響可能遮蔽了檢測。確保采用說明書推薦的稀釋度。

  如果確實(shí)采用的是推薦的稀釋度，則檢查稀釋操作是否正確。過度稀釋將導(dǎo)致樣品值低于標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍。

  問：我怎樣補(bǔ)償樣品的稀釋度或者濃縮度?

  答：如果樣品是稀釋型的，標(biāo)準(zhǔn)曲線所讀取的值必需乘以稀釋度。

  如果樣品是濃縮型的，標(biāo)準(zhǔn)曲線所讀取的值必需除以濃縮比。

  小建議：

  1.確定待檢測的樣品在收集和制備時(shí)保證無菌操作。

  2.如果要檢測多個(gè)樣品，將樣品隔離并標(biāo)記清楚以防相互污染。

  3.檢測前，將樣品離心除去顆粒。將樣品轉(zhuǎn)移至新的離心管內(nèi)，混合均勻。

  4.在混合樣品時(shí)，使用容積至少比樣品體積大50%的離心管以保證混合充分。

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