北京百奧萊博供應的Real Time PCR預混試用于科學研究，我公司的Real Time PCR預混試品質上佳，經過多年的開發(fā)生產，已然非常成熟，歡迎廣大新老客戶訂購。

北京百奧萊博科技有限公司是一家專業(yè)的生物試劑銷售公司。公司主要經營血清、抗原、抗體等生物試劑產品，可以為您提供專業(yè)的技術服務，以優(yōu)良的價格、優(yōu)質的服務、優(yōu)先的理念，滿足客戶的各方面的需求，與國內多家企業(yè)、單位建立了良好的長期合作關系，擁有較好的企業(yè)信譽和品牌形象。

特別提示：包括Real Time PCR預混試劑（探針法,含指示劑)在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產品名稱：Real Time PCR預混試劑（探針法,含指示劑)
英文名稱：SuperReal PreMix Color（Probe)
產品貨號：WH0108
產品規(guī)格：125次|500次

本制品是采用探針法進行Real-Time PCR的專用試劑，為2×濃度的PreMix形式，反應液配制十分簡單方便。產品額外添加了指示劑，利于大量樣品的加樣，減少誤操概率。

SuperReal Color PreMix采用了獨特的雙組分熱啟動DNA聚合酶（化學修飾的HotStar Taq DNA聚合酶和抗體修飾的Anti Taq DNA聚合酶），配合精心優(yōu)化buffer體系，具有定量準確，擴增效率高，重復性好和寬廣的可信范圍的特點。

產品特點：
1．SuperReal Color PreMix采用了獨特的雙組分熱啟動DNA聚合酶（化學修飾的HotStar Taq DNA聚合酶和抗體修飾的Anti Taq DNA聚合酶)，從而構成酶活自動調節(jié)系統(tǒng)，配合精心優(yōu)化的buffer體系，具有定量準確，擴增效率高，重復性好和寬廣的可信范圍的特點。
2．本產品經過優(yōu)化使熒光信號的釋放達到zuì佳的效果，同時充分降解了探針熒光淬滅基團的信號釋放，用相同量的模板將得到更強的信號。
3．SuperReal Color PreMix為2×濃度的PreMix形式，PCR反應液配制時，只需加入模板、引物、無RNA酶超純水便可進行Real Time PCR反應，操作簡單方便。
4．本產品附帶ROX Reference Dye，用于消除信號本底以及校正孔與孔之間產生的熒光信號誤差，方便客戶針對不同型號熒光定量PCR儀時選擇對應濃度使用。
5．添加顏色指示劑，令加樣更加簡便，有效降低誤操作概率。


試劑盒原理：
本制品采用了獨特的雙組分熱啟動DNA聚合酶進行PCR擴增，通過在PCR反應液中加入熒光探針，然后檢測反應進程中的熒光強度，達到檢測PCR產物擴增量的目的。

本制品中雙熱啟動酶構成了獨特的酶活自動調節(jié)系統(tǒng)。酶活自動調節(jié)系統(tǒng)是由化學修飾的HotStar Taq DNA聚合酶和抗體修飾的Anti Taq DNA聚合酶組成。其中HotStar Taq DNA聚合酶占大部分比例，其聚合酶活性的激活是嚴格依賴于95℃高溫的一個緩釋過程，而Anti Taq DNA聚合酶則在95℃高溫下完全激活。經過95℃條件下孵育15min激活大部分HotStar Taq DNA聚合酶，進入PCR循環(huán)后，每經過一輪95℃條件下變性，即可重新激活一部分HotStar Taq DNA聚合酶。HotStar Taq DNA聚合酶獨特的酶活緩釋機制使其可以與Anti Taq DNA聚合酶構成獨特的酶活自動調節(jié)系統(tǒng)。PCR反應初期，完全激活的Anti Taq DNA聚合酶可以協(xié)同已經激活的HotStar Taq DNA聚合酶達到zuì佳酶活狀態(tài)，而在整個PCR反應過程中，每一輪新釋放的HotStart Taq DNA聚合酶活力剛好可以彌補因熱變性所導致的部分酶活損失。因此，SuperReal Color PreMix在整個PCR反應過程始終保持zuì佳的DNA聚合酶活力，配合精心優(yōu)化Buffer體系，從而具有定量準確，擴增效率高，重復性好和寬廣的可信范圍的特點。

本制品經過優(yōu)化特別有利于Taq酶發(fā)揮其5"-3"外切酶活性，使熒光信號的釋放達到zuì佳的效果。此外，SuperReal Color PreMix也充分降解了探針熒光淬滅基團的信號釋放，經過上述優(yōu)化，用相同量的模板將得到更強的信號。

試劑盒組成：

組分	20μl×125次	20μl×500次
2×SuperReal Color PreMix（Probe)	1.25ml	4×1.25ml
50×ROX Reference Dye	250μl	1 ml
40×樣本稀釋液（黃色)	1.25ml	1.25ml
RNase-Free ddH2O	2×1 ml	5×1 ml

儲存條件：收到本產品后，請立即置于-20℃保存。從-20℃取出使用時，將凍存的2×SuperReal Color PreMix和50×ROX Reference Dye融解，然后輕輕顛倒混勻，待溶液完全均一后再行使用。如解凍后沒有使用，須徹底混勻后重新冷凍（在解凍過程中鹽會出現(xiàn)分層現(xiàn)象，未混勻進行冷凍，鹽晶體的析出將會對酶造成損害)。如需一段時間內經常取用，可在2-8℃條件下儲存3個月。避免反復多次凍融。

注意事項：請務必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項。
1．PCR反應的預變性條件必須設定為95℃ 15min，用以激活熱啟動酶。
2．PCR反應液中各顏色指示劑的終濃度應為1×，請根據(jù)模板的添加量計算Dilution Buffer的用量。
3．如果試劑沒有混勻，其反應性能會有所下降。使用時請上下顛倒輕輕混勻，請不要使用振蕩器進行混勻，盡量避免出現(xiàn)泡沫，并經瞬時離心后使用。
4．本產品中不含有熒光探針等。
5．引物終濃度為300 nM，探針終濃度為200 nM可以在大多數(shù)體系中獲得良好的擴增結果。
6．需要進一步優(yōu)化引物濃度的，可以在50-900 nM范圍內調整；需要進一步優(yōu)化探針濃度的，可以在100-500 nM范圍內調整。

進行RT-qPCR反應時的操作建議：
進行RT-PCR反應時，有兩種cDNA鏈合成試劑盒可以選擇，分別是QuickQuant RT Kit （with gDNase) （WH0098)和Baiscript II cDNA鏈合成試劑盒（WH0099)。與本產品配合使用，可以獲得可信性高的PCR反應結果。

操作步驟：

一、建立Real-Time PCR反應體系：
1．解凍2×SuperReal Color PreMix （如果保存在-20℃)，50×ROX Reference Dye，模板，引物和RNase-Free ddH2O，并將所有試劑在室溫下平衡并徹底混勻。
2.建議置于冰上進行Real-Time PCR反應液的配制。
  40×Dilution Buffer為黃色，2×SuperReal Color PreMix為藍色。如需稀釋模板，則zuì終反應體系應為綠色；否則體系應為藍色。如顏色不符，請檢查體系中是否正確加入相關組分。反應體系如下：

成分	50μl體系	25μl體系	20μl體系	終濃度
2×SuperReal Color PreMix	25μl	12.5μl	10μl	1×
正向引物（10μM)	1.5μl	0.75μl	0.6μl	0.3μM①
反向引物（10μM)	1.5μl	0.75μl	0.6μl	0.3μM①
熒光探針（10μM)	1μl	0.5μl	0.4μl	0.2μM②
DNA模板（含Dilution Buffer)④	-	-	-	≤200ng
50×ROX Reference Dye③	-	-	-	-
RNase-free ddH2O	至50μl	至25μl	至20μl	-

①引物終濃度為300 nM可以在大多數(shù)體系中獲得良好的擴增結果。擴增效率不高時，可增加PCR反應體系中的引物濃度；發(fā)生非特異擴增時，可適當減少PCR反應體系中的引物濃度。需要進一步優(yōu)化引物濃度的，可以在50-900 nM范圍內調整。
②探針的濃度與使用的Real-Time PCR擴增儀、探針種類、熒光標記物質種類有關，實際使用時請參照儀器說明書，或各熒光探針的具體使用說明進行。通常探針終濃度為200 nM可以在大多數(shù)體系中獲得良好的擴增結果。需要進一步優(yōu)化探針濃度的，可以在100-500 nM范圍內調整。
③幾種常見儀器的zuì適ROX Reference Dye濃度如下：
 ABI PRISM 7000/7300/7700/7900HT/StepOne等：2.5× （例如：2.5μl ROX/50μl體系)
 ABI 7500、7500 Fast；Stratagene Mx3000P、Mx3005P和Mx4000等：0.5× （例如：0.5μl ROX/50μl體系)
 Roche儀器，Bio-Rad儀器，Eppendorf儀器等：無需添加。
④如需稀釋模板，應先將cDNA模板與40×Dilution Buffer按一定比例混合成稀釋模板。稀釋比例如下：
 20μl反應體系中cDNA用量與40×Dilution Buffer含量對應表：

20μl PCR體系中稀釋 模板的添加量	1μl	2μl	2.5μl	3μl	4μl	5μl	6μl
稀釋模板中Dilution Buffer的濃度	20×	10×	8×	6.7×	5×	4×	3.3×
100μl稀釋模板中所需 40×Dilution Buffer的量	50μl	25μl	20μl	16.7μl	12.5μl	10μl	8.4μl
100μl稀釋模板中所需 cDNA的量	50μl	75μl	80μl	83.3μl	87.5μl	90μl	91.6μl

二、進行Real time PCR反應：
建議采用兩步法PCR反應程序進行反應。變性時間可在1-3 sec范圍內進行調整，退火/延伸時間可在20-32 sec范圍內進行調整。

兩步法反應程序：

階段	循環(huán)	溫度	時間	內容	熒光信號采集
預變性	1×	95℃	15min	預變性	否
PCR反應	40×	95℃	3sec⑤	變性	否
		60℃	20-32sec⑥	退火/延伸	是

⑤使用不同型號儀器進行時間設定時，請按照儀器使用說明書要求進行實驗操作，使用ABI 7900HT/7900HT Fast/ViiA 7/StepOne/StepOnePlus時可設定為1 sec。
⑥使用不同型號儀器進行時間設定時，請按照儀器使用說明書要求進行實驗操作，幾種常見儀器的時間設定見下表：
 使用時Roche LightCycler/LightCycler 480請設定在20 sec。
 使用ABI 7500 Fast/7900HT/7900HT Fast/ViiA 7/StepOne/StepOnePlus時請設定在30 sec。
 使用ABI 7000和7300時請設定在31 sec。
 使用ABI 7500時請設定在32 sec。

3．蓋上反應管，輕柔混勻?？啥虝弘x心，確保所有組分均在管底。
4．將反應體系置于熒光定量PCR儀中，開始反應。

引物設計說明：
進行Real Time PCR反應時，PCR引物的設計非常重要。設計PCR擴增效率高，反應特異性強的引物可以參考以下要求。
1．引物長度：18-30個堿基。
2．GC含量：40-60%
3．Tm值：引物軟件都可以給出Tm，與引物長度，堿基組成，引物使用緩沖的離子強度也有關。上下游引物的Tm值要盡量接近。簡單的Tm計算公式為：Tm = 4℃（G + C)+ 2℃（A + T)。一般采用較引物Tm值低5℃作為PCR退火溫度。提高退火溫度可以增加PCR反應的特異性。
4．PCR擴增產物長度zuì好在100-150 bp之間。盡量避開在模板的二級結構區(qū)域設計引物。避免上下游引物3"端之間形成2個或以上的互補堿基以減少引物二聚體的形成。引物3"端堿基不能有多于3個連續(xù)的G或C。引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾狀結構。避免引物3"末端堿基為T。引物序列中A、T、G、C要盡量均勻分布。

探針設計說明：
請準備適用于目的基因序列的熒光probe。Probe序列的設計請參考各probe的設計指導。
另外，請盡可能使用HPLC級別以上純化的probe，否則殘留的未結合的熒光染料會造成基線上飄從而降低檢測的靈敏度。

常見問題：

1．低濃度模板時擴增曲線混亂，熒光強度變弱

原因	解決辦法
目標DNA的拷貝數(shù)過少	反應液中的目標DNA拷貝數(shù)只有幾倍到幾十倍時，拷貝數(shù)散亂的概率變大，容易形成線性混亂。請適當提高樣品濃度再進行反應。
與引物二聚體發(fā)生競爭	目的片段擴增的同時出現(xiàn)引物二聚體的擴增，由于競爭使目的片段的擴增反應變弱。請摸索反應條件或重新設計引物，以防止引物二聚體的形成。
DNA被反應離心管吸附而損失	模板濃度較低或樣品稀釋后長時間存放時，會導致DNA被反應離心管吸附而損失。請?zhí)岣邩悠窛舛仍龠M行反應。如果對樣品進行稀釋，建議稀釋后立即進行反應。

2．NTC可見擴增

原因	解決辦法
發(fā)生交叉污染	請更換新的試劑或滅菌水。仍無法得到改善時，請嘗試到新的實驗環(huán)境進行操作。
儀器設定誤差（進行多重PCR時等)	當使用幾種熒光探針時，請正確設定熒光測定，防止出現(xiàn)因不同染料的光譜交叉而導致的檢測信號差異。

3．定量值重現(xiàn)性差

原因	解決辦法
儀器方面的故障	因為儀器的不適用，在溫度管理或檢測時產生重現(xiàn)性差。請根據(jù)相應儀器的說明書進行點檢。
樣品純度不好	不純的樣品會導致實驗的重現(xiàn)性差。
稀釋的模板放置太久	濃度較低的DNA溶液存放時間較長時，由于被管壁吸附從而實際濃度會更低，建議從原液重新稀釋后再進行反應。另外，通過梯度稀釋的標準樣品zuì好每次使用時直接從原液稀釋。
引物或探針質量下降	盡量避免新合成引物批次間的差異，可以使用原來質量好的引物做為對照。
PCR反應條件、引物濃度、序列等不恰當	擴增效率差的PCR較容易產生重現(xiàn)性差。通過變更引物和探針的濃度或PCR反應條件來進行調整。擴增不好時，一般可降低退火溫度或提高引物濃度，也可以延長延伸時間。如模板的GC含量較高，可延長變性時間。仍得不到改善時，建議重新設計引物和探針。
計量誤差	反應體積太小會導致檢測精度下降。請根據(jù)定量PCR儀推薦的反應體積重新實驗。

4．擴增效率低于90% （slope<-3.6)

原因	解決辦法
引物質量不好	當引物質量不好時，會導致擴增效率大幅下降。可從引物原液重新稀釋，或重新合成引物。
計算擴增效率時未排除偏離直線的Ct值	計算擴增效率時包含了偏離直線的Ct值，增大了計算值的誤差。應將偏離直線的Ct值排除后再計算。
反應條件不合適	請優(yōu)化引物，探針濃度及PCR反應條件。

5．擴增效率高于110% （slope>-3.1)

原因	解決辦法
計算擴增效率時未排除偏離直線的Ct值	計算擴增效率時包含了偏離直線的Ct值，增大了計算值的誤差。應將偏離直線的Ct值排除后再計算。
樣品中的雜質對高濃度模板抑制明顯	當樣品含有雜質時，對高濃度模板抑制明顯，從而增大了擴增效率。請降低樣品濃度，或進一步純化模板。

6．擴增曲線熒光信號很弱，或擴增曲線呈鋸齒狀

原因	解決辦法
檢測光光譜設定誤差	由于目前不同熒光定量PCR儀的原理和提供的檢測光光譜范圍的差異，因此在選擇探針的發(fā)光基團和淬滅基團時一定要根據(jù)所用的儀器型號設置的可檢測的熒光信號范圍內選擇。請參照儀器的使用說明書，重新確定參數(shù)設置。
熒光探針純度太低	請使用HPLC級別以上純化的Probe，否則殘留的未結合的熒光染料會造成基線上飄，從而導致擴增產物所產生的熒光值變低。
熒光探針質量較差	由于探針保存中分解導致基線上飄，從而導致擴增產物所產生的熒光值變低。此外，一部分熒光染料不適合含有EDTA的buffer進行保存。請按照Probe合成公司推薦的保存條件。
熒光采集時間太短	對部分儀器，需要更長的延伸時間來充分采集熒光。擴增曲線鋸齒狀較明顯時，將延伸時間設定為45-60 sec可得到改善。

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名稱：石蠟油，PCR級
貨號：BTN130841
規(guī)格：10mL
本產品是PCR級石蠟油試劑，專門用于PCR擴增、WGA擴增等實驗時添加到反應體系中，封閉反應成分，防止溶液的揮發(fā)。

儲存條件：常溫運輸及保存，有效期一年。

名稱：即用型熱啟動PCR試劑盒
貨號：BTN130986
規(guī)格：1.5mL
本產品是即用型的2×高保真PCR預配反應液，含有除引物、模板以外的所有PCR 試劑，包括Pfu DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應緩沖液、PCR 增強劑、上樣染料等，特別適合于高保真PCR反應。

產品特點：
1. Pfu DNA聚合酶是使用zuì廣泛的高保真酶，其保真度為普通Taq酶的10倍。
2. 使用時只需在加入模板和引物并稀釋到1倍濃度即可進行PCR反應，非常方便，簡化了PCR的準備工作。
3. PCR反應所必需試劑全集于一管之中，數(shù)分鐘即可完成反應體系配置。由于加樣過程少，有利于減少污染，降低實驗誤差。
4. 本產品A型含電泳染料，PCR反應液可直接上樣電泳，進一步簡化了操作。
5. 由于各成分的濃度和比例都經過精心優(yōu)化，反應的靈敏度高，特異性強。
6.適用于基因的高保真擴增和基因定點突變等實驗，得到的PCR產物可用于平末端克隆。

儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，保存期限為12個月。

使用方法：
將本產品與用戶自備的模板，引物混合液按下列推薦使用量(30μL反應體系)加入PCR 管中即可進行PCR，反應結束后直接取5-15μL電泳檢查擴增結果。如果反應體系不是30μL，各成分需要按比例增加或減少。

試劑		加入量
Hotstart PCR Mix		25μL
DNA模板(自備)	哺乳動物基因組DNA	0.5-1μg
	酵母基因組DNA	5-500ng
	細菌基因組DNA	0.5-50ng
	質粒DNA	5-500pg
	PCR回收片段	1-100pg
PCR引物(自備)		10pmol each
補水到		30μL

放入PCR 儀中，根據(jù)用戶確定的參數(shù)進行PCR，擴增結束后取5-10μL上樣電泳。
注：用戶可按照每1.5mL Hotstart PCR Mix中加入60μl 專用染料的比例將60μl 專用染料加入到1.5mL PCR MagicMix 3.0中，本染料對PCR擴增效率沒有任何影響。擴增結束后，可直接取PCR反應液上樣電泳，不需要額外再加DNA上樣液。

注意事項：
1．如果反應體系不是30μl，各成分需要等按比例增加或減少。
2．如果DNA 模板中有PCR 不明抑制物(植物、土壤和血液等DNA樣品常含此類抑制物)，可以在PCR 體系中加入1/10的PCR 抑制物清除劑(BTN60804，30μl 體系中加3μl)，可能會對PCR 有幫助。

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貨號	名稱	規(guī)格
BTN131141	dNTP和引物清除劑	100次
WE0122	FastStar熱啟動DNA聚合酶	500U|2500U
WE0149	一步法逆轉錄實時熒光定量PCR試劑盒(低含量ROX校正染料)	100次
WE0159	dNTP混合溶液(10 mM)	1ml|5ml
ALH241	2×Pfu PCR MasterMix	0.5ml|5ml
ALH264	熒光定量用鏈反轉錄預混合液	20μl×50次

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