ECM Kit(小鼠IgM)的品牌是百奧萊博，是優(yōu)質(zhì)的免疫檢測(cè)產(chǎn)品，本制品僅用于生物化學(xué)研究方面，ECM Kit(小鼠IgM)是我司眾多優(yōu)質(zhì)免疫檢測(cè)之一，質(zhì)量堪比同類進(jìn)口產(chǎn)品，價(jià)格非常優(yōu)惠，目前正熱烈促銷中，恭候您的咨詢訂購(gòu)。...

特別提示：包括ECM Kit(小鼠IgM)在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：ECM Kit(小鼠IgM)
產(chǎn)品貨號(hào)：ZN1929
產(chǎn)品規(guī)格：1盒

用途：適于一抗為小鼠 IgM的Western Blotting 檢測(cè)。
保存條件：4℃可保存一年 。
Western Blotting 檢測(cè)試劑盒內(nèi)容：
1.封閉試劑：10g 蛋白質(zhì)干粉(脫脂奶粉)。
2.HRP 標(biāo)記羊抗小鼠 IgM：親和純化抗體，經(jīng)過(guò)人血清吸附以去除交叉抗體。效價(jià) 1：2000-10000。
3.ECM 顯色劑：總量 100ml。含 A 液 5ml(×20倍)；B 液 5ml(×20倍)。每個(gè)試劑盒足夠 10 張小膜或800 c ㎡面積的膜顯色
工作原理：
蛋白質(zhì)的電泳分離是重要的生物化學(xué)分離純化技術(shù)之一,電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)作用下 ,向著與其電荷相反的電移動(dòng)的現(xiàn)象。根據(jù)所采用的支持物不同,可分為：瓊脂糖凝膠電
泳、淀粉凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。其中以聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)zuì廣泛。它的優(yōu)點(diǎn)為：無(wú)電滲作用,樣品用量少(1-100μg),分辨率高,可檢出 10-9-10-12mol的樣品,凝膠機(jī)械強(qiáng)度大,重復(fù)性好以及可以通過(guò)調(diào)節(jié)單體濃度或單體與交聯(lián)劑的比例而得到孔徑不同的凝膠。
SDS-PAGE 是zuì常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方式,它根據(jù)蛋白分子大小不同，遷移速率的不同而達(dá)到分離目的，特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測(cè)和測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。
免疫印跡是將凝膠電泳的高分辨力和免疫化學(xué)檢測(cè)的特異性融為一體。免疫印跡技術(shù)先借助凝膠電泳將蛋白質(zhì)抗原分離，然后將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到膜上使之成為被分離的一個(gè)拷貝。免疫印跡為檢測(cè)樣品中是否存在蛋白的抗原提供一種可靠的方法，該法鑒定蛋白質(zhì)的原理是根據(jù)被測(cè)蛋白能與特異性抗體結(jié)合的特性并通過(guò)相對(duì)遷移率來(lái)體現(xiàn)該蛋白的分子量。
如果想要了解樣品中是否存在某一抗原，以及該抗原的含量或該抗原多肽鏈的相對(duì)分子質(zhì)量以及亞型，是否與其他蛋白結(jié)合，蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基是否發(fā)生磷酸化等有關(guān)問(wèn)題均可采用免疫印跡。
免疫印跡包括多個(gè)簡(jiǎn)單步驟，可在一到兩天完成，該方法具有，簡(jiǎn)便，靈敏等特點(diǎn)。
實(shí)驗(yàn)操作步驟：
1．蛋白質(zhì)的樣品制備：
1)細(xì)胞培養(yǎng)蛋白質(zhì)樣品的制備：
1：胰酶消化后裂解：細(xì)胞培養(yǎng)至 80%左右密度時(shí)，以含 0.25%胰蛋白酶消化,室溫，低速離心，棄上清。細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS 漂洗3次，加入 0.1-1ml 裂解液(根據(jù)細(xì)胞數(shù)量定)反復(fù)吹打。
2：皿上直接裂解：細(xì)胞培養(yǎng)至 80%左右密度時(shí)，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS 漂洗3次，加入 0.1-1ml 裂解液(根據(jù)細(xì)胞數(shù)量定)，用細(xì)胞刮刀收集，轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)吹打。
2)組織樣品的制備：新鮮組織塊迅速置于預(yù)冷的生理鹽水中，漂洗數(shù)次，按組織凈重：裂解液=1：10-20的比例，加入相應(yīng)體積的裂解液進(jìn)行勻漿，離心收集上清(如有粘稠物可超聲處理)
3)蛋白變性：處理后的樣品加入樣品緩沖液(按樣品濃度 1：1或1：2的比例)混勻，樣品置 1000C的水浴箱加熱 3-5分鐘，10000g 離心 10分鐘，取上清液。(樣品可立即使用也可以分裝凍存，-20℃可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月。)
2．SDS-PAGE 電泳：
1)．制 膠：①按比例配制分離膠(丙烯酰胺母液：?jiǎn)误w：雙體=29：1)，緩緩地?fù)u動(dòng)溶液，使激活劑混合均勻，將凝膠溶液平緩地注入兩層玻璃中，再在液面上小心注入一層水或正丁醇，以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液中，37℃恒溫箱中靜置 60min。
②同前按比例配制濃縮膠，但混勻溶液時(shí)不要過(guò)于劇烈以免引入過(guò)多的氧氣。吸去不連續(xù)系統(tǒng)中下層分離膠上的水分，以連續(xù)平穩(wěn)的液流注入凝膠溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齒尖留有氣泡，37℃恒溫箱中靜置60min 以上以保證完全聚合。
2)加 樣：依次加入標(biāo)準(zhǔn)品和待分析樣品。(加樣時(shí)間要盡量短，以免樣品擴(kuò)散，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液避免邊緣效應(yīng)。樣品一般在 1.0mm 厚的膠 加樣 50-100ug/lane)。
3)電 泳：加樣完畢，選擇適當(dāng)?shù)碾妷哼M(jìn)行電泳即可。一般采用恒壓濃縮膠 55V，分離膠 75V，電泳直至溴酚藍(lán)染料前沿下至凝膠末端處，即停止電泳。
3．轉(zhuǎn) 膜：蛋白質(zhì)經(jīng) SDS-PAGE 分離后，從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上，常用的支持物有：硝酸纖維膜即 NC 膜(AR0135)或PVDF 膜。Tris/甘氨酸-SDS-PAGE 結(jié)束后，取出凝膠，在 Tris/甘氨酸緩沖液中漂洗數(shù)秒。蛋白質(zhì)從凝膠向膜轉(zhuǎn)移的過(guò)程普遍采用電轉(zhuǎn)印法，包括濕式電轉(zhuǎn)印和干式電轉(zhuǎn)印。
1)干式電轉(zhuǎn)?。簩⑥D(zhuǎn)印槽陰平放工作臺(tái)上，并在上面加三張電轉(zhuǎn)印液浸透的1mm厚的濾紙，將電轉(zhuǎn)印液浸透 0.45μm的N.C 膜放在濾紙上，再將凝膠平放在 N.C 膜上，zuì后在凝膠上加蓋三層電轉(zhuǎn)印液浸透 1mm 厚的濾紙，電流根據(jù)凝膠面積按1-2 mA/cm2,接通電源，經(jīng) 1-1.5 小時(shí)電轉(zhuǎn)印。
2)濕式電轉(zhuǎn)印：打開(kāi)電轉(zhuǎn)印夾，每側(cè)墊上一塊專用的用轉(zhuǎn)印液浸泡透的海面墊，再各放三塊轉(zhuǎn)印液浸透的濾紙，濾紙與海面墊大小相同或與 NC 膜、凝膠大小相同均可，將凝膠平放在陰側(cè)濾紙上，zuì后將 NC 膜平放在凝膠上，按照(-)夾板-海棉-濾紙-膠塊-NC 膜-濾紙-海綿-夾板(+)裝好,依次除盡每層間氣泡，夾好電轉(zhuǎn)印夾。 電泳槽加滿預(yù)冷電轉(zhuǎn)印液，插入電轉(zhuǎn)印夾，將電泳槽放入冰箱內(nèi)，連接好電，接通電流，轉(zhuǎn)印夾的NC 膜應(yīng)對(duì)電泳槽的正,4℃ 250-300mA,轉(zhuǎn)印 80min(根據(jù)分子量不同，轉(zhuǎn)印時(shí)間可適當(dāng)調(diào)整)。
4、膜的封閉：漂洗轉(zhuǎn)印膜,室溫，3次 x10min,以盡量洗去轉(zhuǎn)印膜上的SDS(以免影響抗體的結(jié)合)，放入 0.02M TBS 緩沖液配置的5%脫脂奶粉和 1%的BSA 混合的封閉液內(nèi)，搖床搖動(dòng)，室溫封閉 2h或4℃過(guò)夜。1×TBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗10min。
5、抗體雜交：1)封閉后的雜交膜放入雜交袋中，加入用 0.02M TBS 緩沖液配置的2%脫脂奶粉和 1%的BSA 混合的稀釋液適當(dāng)稀釋的適當(dāng)稀釋的一抗，4℃孵育過(guò)夜或37℃孵育2h，1×TBS-T ，PH7.6洗液洗膜 3次 x10min。(一抗的稀釋度，孵育時(shí)間，溫度與顯色強(qiáng)度，背景有直接關(guān)系。一般來(lái)說(shuō)，陽(yáng)性不強(qiáng)時(shí)可提高一抗?jié)舛群脱娱L(zhǎng)孵育時(shí)間，而背景高，非特異性條帶多，則降低抗體濃度和孵育時(shí)間)。
2)用 0.02M TBS 緩沖液配置的2%脫脂奶粉和 1%的BSA 混合的稀釋液適當(dāng)稀釋過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠 IgM 孵育膜，20℃-37℃,1.5 小時(shí)或4℃過(guò)夜，1×TBS-T洗膜 3 x10min。
6、顯色(ECM)
ECM 顯色劑配制:按 1ml 蒸餾水，加顯色劑 A、B 各 1 滴混勻。將雜交后印跡膜放入顯色盒中,加上混合好的顯色液反應(yīng)約 1-5分鐘。吸去印跡膜邊緣顯色液,將一透明的玻璃紙蓋住撫平,以確?！粮泄饽z片的干燥。印跡膜轉(zhuǎn)入暗室中使膠片曝光 30＇-5分鐘。
7、顯影，定影。 將曝光后的×感光膠片放入顯影液中沖洗至膠片上出現(xiàn)條帶或者膠片透明為止,再放入定影液中定影，膠片可長(zhǎng)期保存。

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名稱：封閉液(用PBS配置，含曲拉通X-100)
貨號(hào)：YT873
規(guī)格：100ml
本品是zuì新一代的快速封閉液，總體效果顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的基于BSA(牛血清白蛋白)、脫脂奶粉、酪蛋白(Casein)等的封閉液及國(guó)外同類產(chǎn)品，可以用于Western blot (WB)、Immunofluorescence (IF)、Immunohistochemistry (IHC)、Immunocytochemitry (IC) 等實(shí)驗(yàn)中的封閉、一抗或二抗的稀釋。本產(chǎn)品配制在PBS中，含有適當(dāng)濃度Triton X-100。 按照每張膜封閉需要5-10ml封閉液計(jì)算，一個(gè)包裝的本產(chǎn)品 可以封閉10-20張膜。

本封閉液快速。封閉時(shí)間通常僅需5-15分鐘，并且和BSA、脫脂奶粉、酪蛋白等傳統(tǒng)封閉液以及國(guó)外同類的快速 封閉液相比，顯示出更強(qiáng)的信噪比(參考下圖)。

本封閉液封閉后背景低。本封閉液不含血清和白蛋白，確保高的信噪比。

本封閉液兼容性好，兼容辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶和生物素標(biāo)記的二抗。本產(chǎn)品中添加了不影響HRP和AP活性的防腐劑，不會(huì)干擾HRP或AP標(biāo)記二抗的檢測(cè)。同時(shí)本產(chǎn)品不含生物素，不會(huì)干擾基于生物素的檢測(cè)。

本封閉液使用靈活。本產(chǎn)品配制在含有適當(dāng)濃度Triton X-100的PBS中，可以直接用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)，但也可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要自行添加Tween-20或Triton X-100 至終濃度為0.05%-0.1%后用于封閉、一抗或二抗的稀釋。

本產(chǎn)品與BSA及國(guó)外同類產(chǎn)品的封閉效果對(duì)比參見(jiàn)下圖。在相同樣品和實(shí)驗(yàn)條件下，僅封閉液及封閉時(shí)間存在如下圖所示的差異時(shí)，我公司的本封閉液封閉后的整體背景明顯低于BSA封閉后的背景，而且目的條帶亮度明顯高于國(guó)外同類品牌產(chǎn)品。


每組實(shí)驗(yàn)從左到右依次為：5μl蛋白Marker，2.5μg蛋白量的HeLa細(xì)胞裂解液，5μg蛋白量的HeLa細(xì)胞裂解液。請(qǐng)注意對(duì)于抗體A，本封閉液比BSA和國(guó)外同類產(chǎn)品具有更低 的背景，并且和國(guó)外同類產(chǎn)品相比信號(hào)明顯更強(qiáng)。對(duì)于抗體B，本封閉液比BSA具有更低的背景，和國(guó)外同類產(chǎn)品相比信號(hào)明顯更強(qiáng)。實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)因樣品、抗體、實(shí)驗(yàn)條件等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

注意事項(xiàng)：
1. 本產(chǎn)品推薦僅使用一次，重復(fù)使用可能會(huì)導(dǎo)致封閉效果下降。但對(duì)于一些信噪比很高的一抗，例如一些內(nèi)參抗體，本封閉液可以重復(fù)使用2-3次?；厥盏姆忾]液請(qǐng)勿與未使用 過(guò)的封閉液混合。
2. 通常本產(chǎn)品用于PVDF膜及NC膜時(shí)的封閉時(shí)間為5-15分鐘。對(duì)于一些背景非常高的抗體，可以嘗試將封閉時(shí)間延長(zhǎng)為30-60分鐘。此外，如有特殊需要，也 完全可以4℃封閉過(guò)夜。
3. 由于沒(méi)有任何一種封閉液是適用于所有實(shí)驗(yàn)體系的，因此對(duì)于一些特殊的實(shí)驗(yàn)，可能需要根據(jù)具體情況考慮使用其它更合適的封閉液。
4. 取放PVDF膜和NC膜應(yīng)使用平頭鑷子，并僅輕輕夾取其邊角，操作過(guò)程須避免膜表面產(chǎn)生劃痕、折痕或壓痕等痕跡。
5. PVDF膜一經(jīng)浸潤(rùn)和活化，需一直保持濕潤(rùn)，根據(jù)Western進(jìn)行到的具體步驟可放置于western轉(zhuǎn)膜液或洗滌液等適當(dāng)溶液中，否則可能會(huì)產(chǎn)生難以封閉的異 常背景。

儲(chǔ)存條件：4℃，有效期一年。

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SY0759	BCIP/NBT顯色試劑盒藍(lán)紫色(IHC)	1kit
SY0775	Tis-EDTA抗原修復(fù)液(50×)	100ml
ZN1887	陽(yáng)性對(duì)照蛋白(組織細(xì)胞)樣本	100μl
ZN1912	封閉蛋白PBS緩沖系統(tǒng)封閉液	500ml
ZN1917	酪蛋白PBS緩沖系統(tǒng)封閉液(干粉)	1包

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