特別提示:包括葡聚糖凝膠G-200在內(nèi),本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn),嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途!
產(chǎn)品名稱:葡聚糖凝膠G-200
英文名稱:Sephadex G-200 medium
產(chǎn)品貨號(hào):QN4084
產(chǎn)品規(guī)格:25g|100g|500g
葡聚糖凝膠是一種珠狀的凝膠,含有大量的羥基,很容易在水中和電解質(zhì)溶液中溶脹。G型的葡聚糖凝膠有各種不同的交聯(lián)度,因此它們的溶脹度和分級(jí)分離范圍也有所不同。葡聚糖凝膠的溶脹度基本上不因鹽和洗滌劑的存在而受影響。
葡聚糖凝膠有不同的粒度。超細(xì)級(jí)的葡聚糖凝膠是用于需要高分辨率的柱色譜和薄層色譜。粗級(jí)和中級(jí)的凝膠用于制備性色譜過程,可在較低的壓力下獲得較高的流速。另外,粗級(jí)也可用于批量工藝。
葡聚糖凝膠G-200利用分子篩作用,進(jìn)行多肽分離、脫鹽、清洗生物提取液、分子量測(cè)定。
凝膠類型:凝膠過濾填料,親水型凝膠
結(jié)構(gòu)成分:交聯(lián)右旋糖酐
粒徑:40~120μm
工作pH值:2~10
操作溫度:4~40℃
球蛋白分離范圍:3000~600000
保存條件:4~25℃
化學(xué)穩(wěn)定性:
葡聚糖凝膠不溶于一切溶劑(除非它被化學(xué)降解)。它在水、鹽溶液、有機(jī)溶劑、堿和弱酸性溶液中都是穩(wěn)定的,在強(qiáng)酸中凝膠骨架的糖昔鍵被水解。長(zhǎng)期接觸氧化劑將破壞凝膠,因而應(yīng)避免使用。
物理穩(wěn)定性:
葡聚糖疑膠并不熔融,可以在濕態(tài)、中性PH進(jìn)行滅菌或在高壓滅菌器120℃、30分鐘而不影響它的色譜性質(zhì)。干態(tài)的凝膠加熱至120℃以上將開始焦糖化。葡聚糖凝膠的機(jī)械強(qiáng)度取決于交聯(lián)度。
使用方法:
1.葡聚糖凝膠預(yù)處理:
在室溫下,將葡聚糖凝膠干粉浸泡于蒸餾水中至少24小時(shí),并不斷攪拌以保證凝膠溶脹,或者用蒸餾水煮沸至少1小時(shí)直至充分溶脹,凝膠體積不再變化。
注:在溶脹前,加入蒸餾水?dāng)嚢韬笫蛊渥匀怀两?,沉降后若上層溶液中漂浮的凝膠碎片顆粒較多,需要重復(fù)多次漂洗將其除去,防止層析時(shí)阻塞凝膠柱,影響流速。
2.裝柱:
將溶脹好的凝膠根據(jù)裝柱要求一次性置入柱內(nèi),注意保持濕態(tài)裝柱,并避免柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡或斷層; 裝柱要均勻,可在凝膠耐受的操作壓下裝柱,裝好的凝膠柱可以檢測(cè)柱效,檢測(cè)過濾柱裝填是否合格。
凝膠層析分離度取決于柱高,為分離不同組分,凝膠柱床必須有適宜的高度:分級(jí)分離時(shí),一般需要100cm左右長(zhǎng)的層析柱,柱高與直徑之比為20~100:1,柱高過高時(shí),凝膠擠壓變形阻塞會(huì)引起較大的反壓,應(yīng)當(dāng)盡可能避免;分組分離(例如脫鹽)時(shí)用短柱,柱高控制在40~50cm以下,柱高與直徑的比約為5~10:1。
3.平衡:
上樣前用平衡液平衡層析柱至少3~5個(gè)柱體積直到記錄儀基線變得平穩(wěn)為止(例如流出液的PH值等于上柱的Buffer的PH值);
4.上樣:
分級(jí)分離時(shí)上樣量一般為5%的柱床體積,我們建議初次上樣控制在1~2%的床體積,視分離情況可以調(diào)整;脫鹽時(shí)上樣量可以達(dá)到20%的柱床體積。
樣品溶液如有雜質(zhì)或沉淀應(yīng)過濾或離心除去,樣品的粘度不能過高,否則影響分離效果。
5.洗脫方法:
可以用無(wú)鹽水,也可以采用上柱時(shí)的緩沖液洗脫;在上柱緩沖液中加入NaCl等梯度洗脫或鹽梯度洗脫也可以完全分離純化;
6.在位清洗(CIP)
凝膠使用十次后作一次CIP,目的是去除柱床內(nèi)沉淀的及頑固殘留的蛋白。方法是以40cm/h用1M氫氧化鈉反向清洗四個(gè)柱體積,再以至少三個(gè)柱體積平衡緩沖液再生。
7.保存
凝膠柱暫時(shí)不用,可將其回收,一般方法是將凝膠用水沖洗干凈濾干,可加入0.02%疊氮化鈉防腐或用20%乙醇浸泡,以控制微生物生長(zhǎng)。
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DEAE纖維素DE-52常用作柱色譜用吸附劑,分離提純蛋白質(zhì)、核酸、低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)、酶、細(xì)胞碎片和細(xì)胞。
儲(chǔ)存條件:室溫干燥保存
名稱:DEAE葡聚糖凝膠A-50
貨號(hào):QN4058
規(guī)格:25g
DEAE-SephadexA-50(二乙基氨基乙基葡聚糖A-50)為弱堿性陰離子交換劑。用NaOH將CL-型轉(zhuǎn)變?yōu)镺H-型后,可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白屬于中性蛋白(等電點(diǎn)為PH6.85-7.5),其余均屬酸性蛋白。在PH7.2-7.4的環(huán)境中,酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50吸附,只有γ球蛋白不被吸附。因此,通過柱層析γ球蛋白便可在洗脫中先流出,而其他蛋白則被吸附在柱上,從而便可分離獲得純化的IgG。
基質(zhì):Sephadex
顆粒大?。?0~120μm
zuì大流速:45cm/h
工作pH:pH2.0~9.0
儲(chǔ)存條件:室溫
實(shí)驗(yàn)步驟:
1.預(yù)處理
稱DEAE-Sephadex A-50(下稱A-50)5克,懸于500ml蒸餾水,1小時(shí)后傾去上層細(xì)粒。按每克A-50加0.5M NaOH 15ml的比例,將A-50浸泡于0.5M NaOH中,攪勻,靜置30分鐘,裝入布氏漏斗(墊有2層濾紙)中抽濾,并反復(fù)用蒸餾水抽洗至PH呈中性;再以0.5M HCl同上操作過程處理,zuì后以0.5M NaOH再處理一次。處理完后,將A-50浸泡于0.1M,PH 7.4 PB中過夜。
2.裝柱
① 將層析柱垂直固定于滴定鐵架上,柱底墊一園尼龍紗,出水口接一乳膠或塑料管并關(guān)閉開關(guān)。
② 將0.1M,PH7.4 PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度,再倒入經(jīng)預(yù)處理并以同上緩沖液調(diào)成稀糊狀的A-50。待A-50凝膠沉降2~3cm厚時(shí),啟開出水口螺旋夾,控制流速1ml/分鐘,同時(shí)連續(xù)倒入糊狀A(yù)-50凝膠至所需高度。
③ 關(guān)閉出水口,待A-50凝膠完全沉降后,柱面放一園形濾紙片,以橡皮塞塞緊柱上口,通過插入橡皮塞之針頭及所連接的乳膠或塑料管與洗脫液瓶相連接。
3.平衡
啟開出水口螺旋夾,控制流速12-14滴/分鐘,使約2倍床體積的洗脫液流出。并以PH計(jì)與電導(dǎo)儀分別測(cè)定洗脫液及流出液之PH值與離子強(qiáng)度是否相同。達(dá)到一致時(shí)關(guān)閉出水口,停止平衡。
4.加樣及洗脫
啟開上口橡皮塞及下口螺旋夾,使柱中液體緩慢滴出,當(dāng)柱面液體與柱面相切時(shí),立即關(guān)閉出水口,以毛細(xì)滴管沿柱壁加入樣品(體積應(yīng)<床體積的2%,蛋白濃度以<100mg為宜)。松開出水口螺旋夾使柱面樣品緩慢進(jìn)入柱內(nèi),至與柱面相切時(shí),立即關(guān)閉下口,以少量洗脫液洗柱壁2-3次;再放開出水口,使洗液進(jìn)入床柱,隨后立即于柱面上加入數(shù)ml洗脫液,緊塞柱上口,使整個(gè)洗脫過程成一密閉系統(tǒng)。并控制流速12~14滴/分鐘。
5.收集
開始洗脫的同時(shí)就以試管進(jìn)行收集。每管收集3~5ml。共收集10~15管。
6.測(cè)蛋白
以751-G型紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定每管OD280nm,與OD260nm,按前述公式計(jì)算各管蛋白含量。并以O(shè)D280nm為縱座標(biāo),以試管編號(hào)為橫座標(biāo),繪制洗脫曲線。
7.合并、濃縮
將洗脫峰的上坡段與下坡段各管收集液分別進(jìn)行合并,以PEG(MW6000)洗縮至所需體積,加入0.02%NaN3防腐劑,于4℃保存?zhèn)溆谩?br />
8.A-50凝膠的再生
在柱上先以2M NaCl洗柱上的雜蛋白至流出液的OD280nm<0.02,再以蒸餾水洗去柱中鹽。然后按預(yù)處理過程將A-50再處理一遍即達(dá)再生。近期用時(shí)泡于洗脫緩沖液中4℃保存;近期不用時(shí),以無(wú)水酒精洗2次,再置50℃溫箱烘干,裝瓶?jī)?nèi)保存。
注意事項(xiàng):
1.柱的選擇:從理論上說,只要柱足夠長(zhǎng),就得獲得理想的分辨率,但由于層析柱流速同壓力梯度有關(guān),柱長(zhǎng)增加使流速減慢,峰變寬,分辨率降低。柱的直徑增加,使液體流動(dòng)的不均勻性增加,分辨率明顯下降。
2.純化過程必須嚴(yán)格控制脫緩沖液的PH及離子強(qiáng)度。樣品與A-50凝膠必須用洗脫緩沖液徹底平衡后,才能進(jìn)行柱層析。
3.所裝的柱床必須表面平整,無(wú)溝流及氣泡,否則應(yīng)重裝。
4.洗脫過程中應(yīng)嚴(yán)格控制流速,且勿過快。
5.上樣的體積要小,濃度不宜過高。
6.加樣及整個(gè)洗脫過程中,嚴(yán)防柱面變干。
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