禽流感病毒
禽流感病毒
禽流感病毒
禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原與陰、陽性血清
禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原與陰、陽性血清
英文名 Avian Influenza Virus(H5 Sub-type) Hemagglutination Inhibition Test Antignen and Negative,Positive Sera 漢語拼音 Qinliugan Bingdu H5 Yaxing Xueningyizhishiyan Kangyuan Yu Yin,Yangxing Xueqing
【主要成分與含量】
抗原為滅活的H5亞型禽流感病毒，血凝效價(jià)≥7log2。陽性血清為SPF雞感染禽流感病毒H5亞型制備的高免血清，HI效價(jià)≥7log2。陰性血清為SPF雞血清。
【性狀】 抗原為白色或淡黃色海綿狀疏松團(tuán)塊；陽性血清和陰性血清為微黃色或淡紅色海綿狀疏松團(tuán)塊。易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解。
【作用與用途】 用于HI試驗(yàn)檢測禽流感病毒H5亞型抗體。
【用法與判定】
1 材料
1.1 96孔V型(90度)微量反應(yīng)板、單道及多道微量移液器（配有吸頭）、加樣槽、吸管、燒杯等。
1.2 pH值7.2 0.01mol/L PBS
1.2.1 配制25倍PB 稱量2.74g Na2HPO4 和0.79g NaH2PO。H2O，加蒸餾水至100mL；
1.2.2 配制1倍PBS 量取40ml 25倍PB，加入8.5g NaCl，加蒸餾水至1000mL；
1.2.3 用NaOH或HCl調(diào)pH值至7.2；
1.2.4 69Kpa 15min高壓滅菌或用微孔濾膜過濾除菌。
1.2.5 PBS一經(jīng)使用，于2～8℃保存不超過3周。
1.3 阿氏（Alsevers）液 稱葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g，加蒸餾水至100mL，加熱溶解后調(diào)pH值至6.1，69Kpa 15min高壓滅菌，2～8℃保存?zhèn)溆谩?
1.4 1%雞紅細(xì)胞懸液 采集2～3只SPF公雞或無禽流感和新城疫等抗體的健康公雞的血液與等體積阿氏液混合，用pH值7.2 0.01mol/L PBS液洗滌3次，每次均以3000rpm/min離心5min，洗滌后用PBS配成1%（V/V）紅細(xì)胞懸液，2～8℃保存?zhèn)溆谩?
1.5 抗原溶解 凍干的抗原和血清均按瓶簽上規(guī)格標(biāo)注的量，用PBS溶解。
2 操作術(shù)式
2.1 血凝（HA）試驗(yàn)
2.1.1 在V型微量反應(yīng)板中，每孔加0.025ml PBS。
2.1.2 第l孔加0.025ml抗原，反復(fù)抽打3～5次混勻。
2.1.3 從第1孔吸取0.025ml抗原加入第2孔，混勻后吸取0.025ml加入第3孔，如此進(jìn)行對倍稀釋至第11孔，從第11孔吸取0.025mL棄去。
2.1.4 每孔加0.025mL PBS。
2.1.5 每孔加入0.025mL 1%（V/V）雞紅細(xì)胞懸液。
2.1.6 將反應(yīng)板在振蕩器上震蕩1～2分鐘或輕扣反應(yīng)板混合反應(yīng)物，在室溫（20～25℃）下靜置20～30分鐘或2～8℃ 45～60分鐘。在對照孔紅細(xì)胞顯著呈鈕扣狀時(shí)判定結(jié)果。
2.1.7 結(jié)果判定 將反應(yīng)板傾斜60度，觀察紅細(xì)胞有無淚珠狀流淌，完全無淚珠樣流淌(凝集)的zui高稀釋倍數(shù)為血凝效價(jià)。
2.2 血凝抑制（HI）試驗(yàn)
2.2.1 根據(jù)HA試驗(yàn)測定的效價(jià)，計(jì)算配制4個(gè)血凝單位(4HAU)抗原。HA效價(jià)除以4即為含4HAU抗原的稀釋倍數(shù)。例如，HA效價(jià)為1:256，則4HAU抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1:64（256除以4）。
2.2.2 第1～11孔加入0.025mL PBS，第12孔加入0.05mL PBS。
2.2.3 第1孔加入0.025mL血清，充分混勻后吸0.025mL于第2孔，依次對倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.025mL棄去。
2.2.4 第1～11孔均加入0.025mL的4HAU抗原，在室溫（20～25℃）下靜置30分鐘或2～8℃ 50分鐘。
2.2.5 每孔加入0.025mL 1%（V/V）的雞紅細(xì)胞懸液，震蕩混勻，在室溫（20～25℃）下靜置20～30分鐘或2～8℃ 45～60分鐘，對照紅細(xì)胞將呈明顯鈕扣狀沉于孔底。
3 結(jié)果判定
以完全抑制4 HAU抗原的zui高血清稀釋倍數(shù)判為該血清的HI效價(jià)。當(dāng)陽性對照血清的HI效價(jià)與已知效價(jià)誤差不超過1個(gè)滴度，陰性對照血清效價(jià)不高于21og2時(shí)，試驗(yàn)方可成立。被檢血清HI效價(jià)≤31og2判為陰性；＝41og2判為可疑(可疑樣品應(yīng)重檢，重檢效價(jià)≥41og2判為陽性，≤31og2判為陰性)；≥51og2判為陽性.
【注意事項(xiàng)】
（1）HA和HI試驗(yàn)影響因素甚多，應(yīng)嚴(yán)格控制試驗(yàn)條件。每加一試劑或樣品后需更換吸頭，同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制作用溫度和時(shí)間。
（2）準(zhǔn)確配制紅細(xì)胞懸液，使用時(shí)應(yīng)隨時(shí)振搖。（3）用pH值7.0～7.2的PBS作為稀釋液。
（4）抗原和陰、陽性血清若有污染，應(yīng)廢棄。
（5）準(zhǔn)確配制4HAU抗原，使用前需進(jìn)行滴定，滴定好的抗原應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)用完。
（6）抗原和血清按規(guī)定保存。凍干試劑應(yīng)按規(guī)定的體積用PBS溶解。溶解后2～8℃保存不超過1個(gè)月；可分裝成小包裝，-70℃凍存，隨用隨取。切忌反復(fù)凍融。
（7）鴨、鵝以及哺乳動物的血清一般需進(jìn)行非特異性凝集和抑制素的處理。
（8）同一亞型不同毒株的HI試驗(yàn)抗原，若抗原性存在差異，則檢測同一血清的HI效價(jià)不同。
【廢棄包裝處理措施】
剩余的試劑及空瓶不能隨意丟棄，須經(jīng)加熱或消毒滅菌后方可廢棄。
【規(guī)格】
（1）1ml/瓶
（2）2ml/瓶
【包裝】 10瓶/盒、24盒/箱。
【貯藏與有效期】
-15℃以下保存，有效期為24個(gè)月。
【批準(zhǔn)文號】
獸藥生字（2006）080018076
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