Zymolyase-100T From Arthrobacter luteus

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簡述：

Zymolyase-20T（酵母裂解酶-20T）是通過Arthrobacter luteus(藤黃節桿菌)深層培養獲得的酶制劑，它能有效的裂解活酵母細胞細胞壁。該制劑是利用親和層析法部分純化獲得的凍干酶，其酶活單位是100,000 單位/g.其中主要負責裂解活酵母細胞的酶成分是ß-1,3-葡聚糖昆布五糖水解酶，通過對ß-1,3-葡聚糖連接位水解葡萄糖聚合物，釋放產物主要是昆布五糖。

產品說明：

單位定義：800nm條件下菌液吸光度下降30%，表示一個活力單位。

特異性：此產品的裂解譜包括以下屬的生物：Ashbya, Candida, Debaryomyces, Eremothecium, Endomyces, Hansenula, Hanseniaspora, Kloekera, Kluyveromyces, Lipomyces, Metschikowia, Pichia, Pullularia, Torulopsis, Saccharomyces, Saccharomcopsis, Saccharomycodes, Schwannimomyces and others.

用途:可用于細胞裂解、原生質球形成及葡聚糖水解。

說明:酵母細胞的裂解程度隨酵母菌的種類、生長階段及培養條件而改變。

聲明: Zymolyase是麒麟麥酒股份有限公司（Kirin Brewery Co., Ltd）的注冊商標。

儲存:凍干狀態于2-8°C中保存，若30°C下放置3個月約失去90%活力。

外觀:凍干粉

活力：100,000單位/g

核心酶：ß-1,3-葡聚糖昆布五糖水解酶

其他酶: ß-1,3-葡聚糖酶，約1.0 x 10⁷ 單位 /g

蛋白酶，約1.7 x 10⁴單位 /g

甘露聚糖酶, 約6.0 x 10⁴單位 /g

淀粉酶，木聚糖酶，***酶，微量DNase及Rnase（未檢出）

催化劑：二硫蘇糖醇（DTT）, ß-巰基乙醇及其他的巰基化合物（如半胱氨酸）

適pH及溫度：

pH 7.5, 35°C裂解活酵母細胞

pH 6.5, 45°C水解酵母葡聚糖

pH范圍：pH 5-10間保持穩定

熱穩定性：60°C，5min喪失細胞溶解能力

警告：（1）Zymolase^Ø-100T溶解度低，以懸浮液的狀態使用。如果需制備濃度超過0.05%的無菌酶溶液，則通過將Zymolase^Ø-100T溶解在含5%葡萄糖的緩沖液中（pH 7.5），先配制2%的酶儲存液；（2）吸取懸浮液，留下沉至容器管底的任何物質；（3）不推薦使用**纖維過濾器；（4）稀釋無菌的酶懸浮液至目標濃度。

原生質球制備程序：

1. 室溫條件，5000rpm（3000 xg），5min離心酵母培養物；

2. 收集離心沉淀物（酵母細胞）并記錄濕重；

3. 用TE緩沖液懸浮細胞，加入量為1.4ml/g濕重細胞；（TE緩沖液配方：100 mM Tris [MP 8196231]，pH 8.0，100 mM EDTA [MP195173]）

4. 雙蒸水快速定容，終體積量為3.5ml/g濕重細胞；

5. 按照17.5 ul (總體積的1/200)/ g濕重細胞的量加入ß -巰基乙醇（MP 806445），目的是為了除去細胞外層中的甘露聚糖層；

6. 30°C輕搖溫育混合液，處于對數期生長的培養物處理15min，處于穩定期生長的培養物處理45min；

7. 室溫條件，5000rpm離心5min；

8. 用S緩沖液重新懸浮細胞，加入量為4.0ml/g濕重細胞；（S緩沖液配方：1.0 M 山梨糖[MP 102938]，10 mM PIPES (MP 190257), pH 6.5）

9. 5000rpm離心5min；

10. 再次用S緩沖液（4.0ml/g濕重細胞）懸浮細胞，另外加入Zymolyases（50U /g濕重細胞）；如果Zymolyases配制成附錄所示的溶液，則添加250ul即可。根據實驗情況先優化酶使用量。

11. 30°C輕搖溫育混合液30min，根據以下方式監測原生質球形成程度：

（1） 加1ul樣品到20ul S 緩沖液內，原生質球應該保持完整；

（2） 加1ul樣品到20ul雙蒸水中，原生質球應該破裂；顯微鏡下觀察比較兩個樣品的形態差異。

12．一般情況下反應45-60min，原生質球的形成量>90%，此時4^oC下離心收集細胞，5000rpm，5min；

13. 再次用S緩沖液（2 ml/g濕重細胞）懸浮原生質球，5000rpm離心5min；重復此步驟做第二次清洗；；

14.原生質球離心沉淀物-70^oC凍存。

裂解原生質球獲取細胞核：

溫和的裂解原生質球方法如下; 用3倍體積的18%Ficoll（MP 160003）溶液懸浮細胞離心沉淀物，Ficoll溶解于含有0.5 mM CaCl₂ (MP 195088)的10 mM PIPES 緩沖液內，pH 6.5。

酵母菌基因組DNA的制備：

以下步驟快捷，適合于從少量酵母培養物中制備基因組DNA ：

1. 將過夜培養的10ml酵母菌培養物離心收集細胞，加入280ul TE Buffer（配方見原生質球制備程序中的步驟3），300 ul雙蒸水，3 ul ß -巰基乙醇（MP 806445）；

2. 30^oC溫育45min；

3. 以臺式離心機的zui高速度離心2-3s，棄上清液，沉淀物用500 ul S 緩沖液（配方見原生質球制備程序中的步驟8）懸浮.；再次離心棄上清；

4. 用500 ul含有1 mg/ml Zymolyase 20T（MP 32-092-1）的S緩沖液懸浮細胞沉淀物（或者使用自己認為合適的酶濃度）；

5. 30^oC溫育1小時；

6. 重復步驟3；

7. 用200 ul含有0.1%SDS（MP 190522）和2ug蛋白酶K (MP 809252)的TE 緩沖液懸浮細胞沉淀物；

8. 37^oC溫育3小時，不時的混勻溶液；

9. 調水浴鍋的溫度至65^oC，并溫育20min；

10. 從水浴鍋內取出并冷卻至室溫；

11. 用200ul 1:1的Tris飽和酚-氯仿混合液萃取，漩渦混勻并離心；從離心機內取出并保留上清液；

12. 用200ul氯仿萃取上清液，之后重復漩渦混勻及離心；

13. 加入500ul95%乙醇到上清液內，20^oC沉淀10min；

14. 4^oC下，15,000 xg離心20 min；

15. 自然風干或者于真空離心蒸發濃縮器內晾干除去多余的乙醇，并加入200ul TE緩沖液（含有150 mM NaCl和1 ug核糖核酸酶A (MP 101076)）溶解DNA;

16. 37^oC溫育1小時；

17. 重復步驟11和12；

18. 加入2.5倍體積的95%乙醇，20^oC沉淀10min；

19. 30ul雙蒸水重懸DNA。對1:500的DNA稀釋液測量A₂₆₀，根據消光系數計算DNA產量；

20. 產量大約為40-50ug。

附錄:

制備Zymolyase 100T溶液：

以下配制的溶液適用于該產品的實驗程序中（但并不排除其他類型的母液也適用）

配制200單位/ml的母液，將凍干粉溶于已高壓滅菌的S緩沖液（配方見原生質球制備程序中的步驟8）。

如果不被微生物污染，于4 ^oC下，此母液能2個星期以上時間內保持；

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廠家說明：

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