抗體的制備技術(shù)指導(dǎo)
發(fā)布時(shí)間：2024-01-29瀏覽次數(shù)：776返回列表
抗體（antibody），是一種由漿細(xì)胞（效應(yīng)B細(xì)胞）分泌,（免疫球蛋白不僅僅只是抗體），被免疫系統(tǒng)用來鑒別與中和外來物質(zhì)如細(xì)菌、病毒等的大型Y形蛋白質(zhì)，僅被發(fā)現(xiàn)存在于脊椎動物的血液等體液中，及其B細(xì)胞的細(xì)胞膜表面?？贵w能識別特定外來物的一個(gè)*特征，該外來目標(biāo)被稱為抗原。
一、抗體制備的基本原則：
抗體制備為重要的兩個(gè)原則：適量原則和時(shí)間原則。
1.適量原則:根據(jù)抗原可獲取的難易程度和實(shí)際實(shí)驗(yàn)抗體需求量來決定制備抗體的量，小鼠一個(gè)免疫周期只要200-400ug抗原，一只兔子至少要2mg，而往往高純度抗原獲取的成本都比較高。對于科研來說，能選擇小動物就不要選擇大動物，小動物的抗體產(chǎn)量足以滿足需求；鑒于動物本身個(gè)體的差異性，免疫一只兔子的抗原可以免疫4-5只小鼠，這樣可以有效避免動物個(gè)體差異或動物意外死亡所造的時(shí)間成本浪費(fèi)。
普通的大分子蛋白，通過分子克隆構(gòu)建載體并在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組蛋白，純化鑒定后可直接作為免疫原。
小分子蛋白或化合物等分子量小，需要偶聯(lián)載體對該分子進(jìn)行改造才能使其成為具有免疫原性的抗原，常見偶聯(lián)載體如BSA、OVA、HAS等。
2. 免疫動物
常用于制備抗血清的動物有豚鼠、家兔、雞、大小鼠等，大量生產(chǎn)時(shí)需要用到狗、綿羊、山羊等。
3. 免疫血清的收集
一般家兔、綿羊、山羊可采用靜動脈采血，家兔、豚鼠、大鼠、雞可采用心臟采血，家兔、山羊、綿羊可采用靜脈采血。
4. 免疫血清的純化與鑒定
得到的抗血清需要進(jìn)一步的純化，利用偶聯(lián)了抗原的親和柱進(jìn)行層析，具有高效，特異性強(qiáng)，純度高的特定。接著要鑒定純化蛋白的含量、相對分子的質(zhì)量、純度以及特異性。
5. 免疫血清的保存
建議將抗體分裝后進(jìn)行保存?？贵w一般比較穩(wěn)定，在-80℃ ～-20 ℃可以保存約5年而不會影響效價(jià)，而真空干燥保存時(shí)間可以久。保存前需經(jīng)除菌并添加防腐劑。
抗體制備出來之后,需要進(jìn)一步純化得到純的多抗或單抗,既有利于保存也有利于排除雜蛋白對結(jié)果的影響。常規(guī)用于純化的材料是腹水和細(xì)胞培養(yǎng)上清,而通常經(jīng)過免疫制備的抗體大多數(shù)是IgG的各種亞型,以及少數(shù)是IgM,二者電泳條帶分步大致如下:
三、抗體操作注意事項(xiàng):
每次試驗(yàn)前應(yīng)列出詳細(xì)試驗(yàn)計(jì)劃，其中包含試驗(yàn)意圖、擬用方法、所用一抗和二抗的品種和效價(jià)、預(yù)施行的操作流程計(jì)劃以及預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果等。試驗(yàn)分組編號用玻璃筆標(biāo)記在玻片上，對每一抗體均應(yīng)配以陽性和陰性對照。關(guān)于抗體的操作過程要素：
1．抗體分裝購人的濃縮型抗體，為防止重復(fù)凍融而失效，一般需要分裝在多個(gè)安瓿中，依據(jù)需要量，每安瓿含10一20rA。除留一支現(xiàn)用，其余應(yīng)立即放置低溫冰箱內(nèi)貯存(-20℃以下)。用時(shí)取一支。以免長期保存在4℃冰箱內(nèi)失效。
2．無菌與消毒保持使用中的抗體無菌是困難的，但是與抗體接觸的東西如滴管、吸管、試管、安瓿以及加樣器等通過消毒，盡量削減污染的時(shí)機(jī)．不然抗體極易污染細(xì)菌與真菌，然后敏捷發(fā)生渾濁沉積而失效。
3．抗體稀釋一般按其作業(yè)濃度稀釋，如1：100、1：1000等，然后用旋渦器混勻液體。剩余的抗體可保存在斗℃冰箱內(nèi)．盡量在1—2個(gè)月內(nèi)用完，而不 要放在0℃以下。不然抗體會很快結(jié)冰，重復(fù)凍融可使抗體效價(jià)急劇下降。關(guān)于抗體的稀釋液，在夏天溫度很高時(shí)，參加少許防腐劑如疊氮鈉或柳硫汞等，以免在切片上效果時(shí)間超過10小時(shí)而生真菌。
一、抗體制備的基本原則：
抗體制備為重要的兩個(gè)原則：適量原則和時(shí)間原則。
1.適量原則:根據(jù)抗原可獲取的難易程度和實(shí)際實(shí)驗(yàn)抗體需求量來決定制備抗體的量，小鼠一個(gè)免疫周期只要200-400ug抗原，一只兔子至少要2mg，而往往高純度抗原獲取的成本都比較高。對于科研來說，能選擇小動物就不要選擇大動物，小動物的抗體產(chǎn)量足以滿足需求；鑒于動物本身個(gè)體的差異性，免疫一只兔子的抗原可以免疫4-5只小鼠，這樣可以有效避免動物個(gè)體差異或動物意外死亡所造的時(shí)間成本浪費(fèi)。
2.時(shí)間原則:主要是為了解決抗體需求急迫性問題，解決實(shí)驗(yàn)應(yīng)急問題（畢業(yè)論文或者文章修回補(bǔ)充數(shù)據(jù)或?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)方案變等應(yīng)急問題），對于免疫原性較好、純度較高的抗原，可以使用抗體快速制備方案；目前，商業(yè)化抗體制備公司推出快速抗體制備服務(wù)，主要依賴于水溶性快速佐劑。
二、抗體的制備過程：
1. 免疫原的制備普通的大分子蛋白，通過分子克隆構(gòu)建載體并在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組蛋白，純化鑒定后可直接作為免疫原。
小分子蛋白或化合物等分子量小，需要偶聯(lián)載體對該分子進(jìn)行改造才能使其成為具有免疫原性的抗原，常見偶聯(lián)載體如BSA、OVA、HAS等。
2. 免疫動物
常用于制備抗血清的動物有豚鼠、家兔、雞、大小鼠等，大量生產(chǎn)時(shí)需要用到狗、綿羊、山羊等。
3. 免疫血清的收集
一般家兔、綿羊、山羊可采用靜動脈采血，家兔、豚鼠、大鼠、雞可采用心臟采血，家兔、山羊、綿羊可采用靜脈采血。
4. 免疫血清的純化與鑒定
得到的抗血清需要進(jìn)一步的純化，利用偶聯(lián)了抗原的親和柱進(jìn)行層析，具有高效，特異性強(qiáng)，純度高的特定。接著要鑒定純化蛋白的含量、相對分子的質(zhì)量、純度以及特異性。
5. 免疫血清的保存
建議將抗體分裝后進(jìn)行保存?？贵w一般比較穩(wěn)定，在-80℃ ～-20 ℃可以保存約5年而不會影響效價(jià)，而真空干燥保存時(shí)間可以久。保存前需經(jīng)除菌并添加防腐劑。
抗體制備出來之后,需要進(jìn)一步純化得到純的多抗或單抗,既有利于保存也有利于排除雜蛋白對結(jié)果的影響。常規(guī)用于純化的材料是腹水和細(xì)胞培養(yǎng)上清,而通常經(jīng)過免疫制備的抗體大多數(shù)是IgG的各種亞型,以及少數(shù)是IgM,二者電泳條帶分步大致如下:
三、抗體操作注意事項(xiàng):
每次試驗(yàn)前應(yīng)列出詳細(xì)試驗(yàn)計(jì)劃，其中包含試驗(yàn)意圖、擬用方法、所用一抗和二抗的品種和效價(jià)、預(yù)施行的操作流程計(jì)劃以及預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果等。試驗(yàn)分組編號用玻璃筆標(biāo)記在玻片上，對每一抗體均應(yīng)配以陽性和陰性對照。關(guān)于抗體的操作過程要素：
1．抗體分裝購人的濃縮型抗體，為防止重復(fù)凍融而失效，一般需要分裝在多個(gè)安瓿中，依據(jù)需要量，每安瓿含10一20rA。除留一支現(xiàn)用，其余應(yīng)立即放置低溫冰箱內(nèi)貯存(-20℃以下)。用時(shí)取一支。以免長期保存在4℃冰箱內(nèi)失效。
2．無菌與消毒保持使用中的抗體無菌是困難的，但是與抗體接觸的東西如滴管、吸管、試管、安瓿以及加樣器等通過消毒，盡量削減污染的時(shí)機(jī)．不然抗體極易污染細(xì)菌與真菌，然后敏捷發(fā)生渾濁沉積而失效。
3．抗體稀釋一般按其作業(yè)濃度稀釋，如1：100、1：1000等，然后用旋渦器混勻液體。剩余的抗體可保存在斗℃冰箱內(nèi)．盡量在1—2個(gè)月內(nèi)用完，而不 要放在0℃以下。不然抗體會很快結(jié)冰，重復(fù)凍融可使抗體效價(jià)急劇下降。關(guān)于抗體的稀釋液，在夏天溫度很高時(shí)，參加少許防腐劑如疊氮鈉或柳硫汞等，以免在切片上效果時(shí)間超過10小時(shí)而生真菌。
