染色質(zhì)免疫沉淀中的對照與抗體選擇

  Input對照：

  在進(jìn)行免疫沉淀前，需要取一部分?jǐn)嗔押蟮娜旧|(zhì)做Input對照。Input是斷裂后的基因組DNA，需要與沉淀后的樣品DNA一起經(jīng)過逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，DNA純化，以及后的PCR或其他方法檢測。Input對照不僅可以驗(yàn)證染色質(zhì)斷裂的效果，還可以根據(jù)Input中的靶序列的含量以及染色質(zhì)沉淀中的靶序列的含量，按照取樣比例換算出ChIP的效率，所以Input對照是ChIP實(shí)驗(yàn)的步驟。

  Beads選擇：

  接下來，利用目的蛋白質(zhì)的特異抗體通過抗原-抗體反應(yīng)形成DNA-蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物，然后使用Agarose beads或Magna beads沉淀此復(fù)合物，特異性地富集與目的蛋白結(jié)合的DNA片段。再經(jīng)過多次洗滌，除去非特異結(jié)合的染色質(zhì)后，用SDS+NaHCO3洗脫免疫沉淀復(fù)合物。Magna beads是近年來出現(xiàn)的一種新型beads，它使用方便，不像Agarose beads那樣容易破裂，所以在操作過程中簡單，而且免去了離心的步驟，節(jié)省不少時(shí)間。

  抗體選擇：

  染色質(zhì)免疫沉淀所選擇的目的蛋白的抗體是ChIP實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。因?yàn)樵诘鞍踪|(zhì)與染色質(zhì)交聯(lián)結(jié)合時(shí)，抗體的抗原表位可能因?yàn)榕c結(jié)合位點(diǎn)的距離太近，不能被抗體識別，所以不能有效地在體內(nèi)形成免疫沉淀復(fù)合物，直接影響ChIP的結(jié)果。所以不是所有的抗體都能做ChIP實(shí)驗(yàn)的，只有經(jīng)過ChIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后的抗體才能確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

  陽性與陰性對照：

  在做ChIP實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要做好實(shí)驗(yàn)對照，因?yàn)闆]有對照，很難對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性進(jìn)行評估。陽性抗體和陰性抗體對照是基本的實(shí)驗(yàn)對照。陽性抗體通常選擇與已知序列相結(jié)合的比較保守的蛋白的抗體，常用的包括組蛋白抗體或RNA Polymerase II抗體等。陰性抗體通常選擇目的蛋白抗體宿主的IgG或血清。目的蛋白抗體的結(jié)果與陽性抗體和陰性抗體的結(jié)果相比較，才能得出正確結(jié)論。另外，還應(yīng)考慮目的蛋白抗體與DNA的非特異性結(jié)合的可能，所以通常還會選擇一對陰性引物，即目的蛋白肯定不會結(jié)合的DNA序列，作為該抗體的陰性對照。佳的陰性對照引物是在靶序列上游的一段與目的蛋白肯定不能結(jié)合的序列。如果目的蛋白沒有商品化的適用于染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的抗體，只有其他用途的抗體時(shí)，可以先做蛋白質(zhì)免疫沉淀(Immunoprecipitation)檢測。如果抗體可以成功的沉淀蛋白，再進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的檢測。

  交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)和DNA的純化

  用不含DNase的RNase和Proteinase K，65 °C保溫6小時(shí)逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，經(jīng)DNA純化柱回收DNA或用酚抽提、乙醇沉淀純化DNA。DNA純化柱純化DNA的質(zhì)量高，有利于下一步PCR等方法的檢測。因?yàn)榧兹┎粌H交聯(lián)DNA-蛋白質(zhì)，還交聯(lián)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，所以還可以對DNA序列上的蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行分析。在逆轉(zhuǎn)交聯(lián)時(shí)不使用Proteinase K，然后用丙酮回收有機(jī)相中的蛋白質(zhì)，進(jìn)行分析。

  DNA的鑒定

  常用的DNA的鑒定方法是半定量PCR和Real-time PCR。由于啟動子區(qū)域的序列具有多樣性的特點(diǎn)，所以不同的細(xì)胞系或不同的動物品系的同一基因的啟動子序列有可能不同。而且啟動子區(qū)域多富含CG的序列，其PCR條件可能需要相應(yīng)調(diào)整。有條件可設(shè)計(jì)不止一對引物來反復(fù)驗(yàn)證ChIP實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(圖1)。

  ChIP技術(shù)的應(yīng)用

  染色質(zhì)免疫沉淀的DNA適用于多種分析方法。如果目的蛋白的靶序列是已知的或需要驗(yàn)證的，可采用狹縫雜交(Slot blot)的方法，把靶序列特異性探針與染色質(zhì)免疫沉淀的DNA雜交，來驗(yàn)證目的蛋白與DNA靶序列的特異性結(jié)合。還可以根據(jù)靶序列設(shè)計(jì)引物，用半定量PCR的方法進(jìn)行測定，或采用Real-time PCR方法進(jìn)行定量分析。如果目的蛋白的靶序列是未知的或高通量的(high-throughput)，可采用Southern雜交。但因?yàn)槊庖叱恋淼腄NA量較少，所以在研究時(shí)通常要用PCR方法擴(kuò)增DNA探針，再進(jìn)行整個(gè)基因組掃描。還可以把沉淀的DNA克隆到載體中，進(jìn)行測序，尋找該序列附近的開放閱讀框，發(fā)現(xiàn)新的基因調(diào)節(jié)序列。

  目前，隨著人類基因組測序工作的基本完成，研究目的蛋白和整個(gè)基因組的相互作用逐漸成為研究的熱點(diǎn)。由于基因組中的信息量非常大，上述常規(guī)方法通常無法滿足科研的需要。近年來發(fā)展起來的ChIP-chip技術(shù)將基因組DNA芯片(chip)技術(shù)與染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChIP)相結(jié)合，為研究目的蛋白與整個(gè)基因組相互作用提供了可能。ChIP-chip 技術(shù)通過標(biāo)記染色質(zhì)免疫沉淀富集的DNA片段，和另一個(gè)被標(biāo)記不同探針的對照組樣品一起，與DNA芯片雜交，再利用各種生物信息學(xué)方法對收集到的信號進(jìn)行分析，具體的實(shí)驗(yàn)步驟請參考Dr. Richard Young在Nature Protocols上的文章。ChIP-chip技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于研究轉(zhuǎn)錄因子在整個(gè)基因組中的信號網(wǎng)絡(luò)染色質(zhì)修飾機(jī)制在基因組中的調(diào)控，DNA的復(fù)制，修復(fù)以及修飾，基因的轉(zhuǎn)錄與核運(yùn)輸?shù)戎T多方面。

  染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)還可用于分析兩種蛋白共同結(jié)合的DNA序列，即ChIP reChIP方法。ChIP reChIP是在次ChIP的基礎(chǔ)上不解交聯(lián)，而繼續(xù)進(jìn)行另一個(gè)目的蛋白的免疫沉淀，從而得到與兩種目的蛋白都結(jié)合的DNA序列。值得注意的是，因?yàn)橥ㄟ^兩次免疫沉淀富集的DNA量比較少，所以在分析時(shí)通常要把多次免疫沉淀的DNA濃縮后再進(jìn)行操作。

  近年來ChIP技術(shù)也被用于研究RNA-蛋白的相互作用，其原理與DNA類似，也包括甲醛固定，超聲波破細(xì)胞，免疫沉淀，交聯(lián)逆轉(zhuǎn)，RNA純化和RNA鑒定等步驟。所不同的是，交聯(lián)逆轉(zhuǎn)只用Proteinase K，要進(jìn)行RNA純化和不含RNase的DNase處理，分析時(shí)用RT-PCR，芯片雜交要用cDNA芯片等。

  隨著免疫沉淀技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)越來越廣受關(guān)注，如何改進(jìn)染色免疫沉淀技術(shù)中的操作也越來越被科研人員所重視。

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