豬乙型腦炎病毒由北京百奧萊博供貨并提供相關(guān)技術(shù)服務(wù)支持，本品用于科學(xué)研究，我公司的豬乙型腦炎病毒品質(zhì)上佳，經(jīng)過多年的開發(fā)生產(chǎn)，已然非常成熟，歡迎廣大新老客戶訂購。...

特別提示：包括豬乙型腦炎病毒(JEV)單重?zé)晒釶CR檢測試劑盒在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱：豬乙型腦炎病毒(JEV)單重?zé)晒釶CR檢測試劑盒
產(chǎn)品貨號(hào)：SYA419
產(chǎn)品規(guī)格：48次/盒|96次/盒

一、簡介：
該方法采用一步法熒光qRT-PCR，反應(yīng)在同一管內(nèi)連續(xù)進(jìn)行，操作簡單，并有效防止了污染，能對(duì)樣品中的豬乙型腦炎病毒進(jìn)行快速檢測,具有特異性高、敏感性強(qiáng)和操作簡便的特點(diǎn)。

二、用途：
該試劑盒適合于檢測發(fā)病動(dòng)物血液、腦脊液、組織以及病毒細(xì)胞培養(yǎng)液等標(biāo)本中豬乙型腦炎病毒(JEV)RNA，適用于豬乙型腦炎病毒(JEV)感染的輔助診斷。

三、試劑盒組成：(48T)
組份 數(shù)量 規(guī)格
JEV熒光qRT-PCR反應(yīng)液(JEV-qRT-PCR MIX) 1管 672μL/管
酶混合物(Enzymes MIX) 1管 48μL/管
無核酸酶水(Nuclease-Free Water) 1管 500μL/管
陰性對(duì)照(NTC) 1管 50μL/管
陽性對(duì)照(JEV-PTC) 1管 50μL/管

四、儲(chǔ)存條件及有效期：
本試劑盒于-20℃以下保存，有效期為6個(gè)月。

五、熒光PCR儀器適用范圍：
ABI系列，Roche系列等熒光定量PCR檢測儀等。
6、樣品的采集與RNA提取
6.1 樣品的采集
適用標(biāo)本類型：發(fā)病動(dòng)物的血液、體液、腦脊液、組織以及病毒培養(yǎng)物等標(biāo)本。
6.1.1 組織：取發(fā)病組織約1g，置入1.5mL潔凈EP管，立即送檢。
6.1.2 血液、體液、腦脊液及病毒培養(yǎng)物：血液，無菌注射器抽取外周血1-2mL注入EDTA2Na(或檸檬酸鈉)抗凝管；體液、腦脊液及病毒培養(yǎng)物液等，無菌條件下取0.5-1mL左右，置入1.5mL潔凈EP管，立即送檢。
6.2 RNA提取
可采購北京百奧萊博科技有限公司生產(chǎn)的RNA提取試劑盒(過柱法-熒光配套)或其他合適的商業(yè)化產(chǎn)品，并按照相應(yīng)試劑盒說明進(jìn)行操作。
 注：陽性對(duì)照和陰性對(duì)照為已經(jīng)抽提好的核酸(無需提取)，直接取5μL 加入到反應(yīng)體系中即可。
由于陽性對(duì)照濃度較高，建議zuì后在樣品制備區(qū)域加入陽性對(duì)照。

七、檢測步驟：
7.1 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光qRT-PCR 反應(yīng)液(JEV-qRT-PCR MIX)，室溫融化并振蕩混勻后，10000rpm 離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽性對(duì)照)，測試反應(yīng)體系配制如下：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14μL N×14μL
酶混合液 1μL N×1μL
總量 15μL N×15μL
計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm 離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL，向每管中加處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽性對(duì)照(JEV-PTC)5μL，10000rpm 瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qRT-PCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
反轉(zhuǎn)錄(Reverse Transcription) 1循環(huán) 45℃ for 10 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 45 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。

八、結(jié)果分析：
8.1 結(jié)果分析條件設(shè)定
直接讀取檢測結(jié)果?；€和閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的zuì高點(diǎn)為準(zhǔn)。
8.2 試驗(yàn)成立判定
(1)陰性對(duì)照(NTC)： 不應(yīng)產(chǎn)生任何的擴(kuò)增曲線。
(2)陽性對(duì)照(JEV-PTC)：均產(chǎn)生擴(kuò)增曲線。
(3)以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則，此次試驗(yàn)視為無效。
8.3 結(jié)果判定
(1)在試驗(yàn)成立的條件下，Ct值≤35的樣本為陽性，表明JEV核酸陽性。
(2)Ct值顯示為無的樣本為陰性樣本，表明JEV核酸陰性。
(3)如果35＜Ct值≤40，判為可疑樣品。對(duì)于可疑樣品，先看擴(kuò)增曲線。如果擴(kuò)增曲線為對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，則為可疑陽性，否則判為陰性。
(4)對(duì)于可疑陽性樣品，重新抽提核酸，再次進(jìn)行JEV qRT-PCR檢測。如果重復(fù)擴(kuò)增曲線為對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線，判為樣本陽性，表明JEV核酸陽性；否則判為樣本陰性。

九、注意事項(xiàng)：
(1)初次使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說明書。并嚴(yán)格按照說明書步驟操作。
(2)所有使用的離心管zuì好高壓滅菌，而且必須不含RNA 酶。
(3)PCR 操作應(yīng)嚴(yán)格按照要求分區(qū)(試劑配制區(qū)、標(biāo)本處理區(qū)、PCR 擴(kuò)增區(qū)等)，防止實(shí)驗(yàn)室污染。
(4)樣本提取、試劑配置、加樣需在不同區(qū)的超凈工作臺(tái)進(jìn)行，以免污染。
(5)試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。


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