CFSE/7-AAD雙染細(xì)胞毒性檢測試劑盒是利用細(xì)胞熒光染料CFSE(CFDA-SE)和7-AAD對細(xì)胞進(jìn)行染色，利用CFSE標(biāo)記靶細(xì)胞，7-AAD標(biāo)記死的靶細(xì)胞來區(qū)分不同的細(xì)胞，活的靶細(xì)胞成綠色，死的靶細(xì)胞成紅色和綠色，從而檢測細(xì)胞毒性作用。...

CFSE/7-AAD雙染細(xì)胞毒性檢測試劑盒

產(chǎn)品編號：HR8312

產(chǎn)品組成：

儲存條件：

CFSE探針-20℃避光保存，7-AAD染色液2-8℃避光保存，有效期1年。

【注】：

● 染料長期不用可以-20℃保存。避免反復(fù)凍融。

● 染色液為DMSO溶液，冬季氣溫較低時為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱融解，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。

● 可以用手捂住使其融解或37℃短時間水浴。吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。

產(chǎn)品簡介：

CFSE/7-AAD雙染細(xì)胞毒性檢測試劑盒是利用細(xì)胞熒光染料CFSE(CFDA-SE)和7-AAD對細(xì)胞進(jìn)行染色，利用CFSE標(biāo)記靶細(xì)胞，7-AAD標(biāo)記死的靶細(xì)胞來區(qū)分不同的細(xì)胞，活的靶細(xì)胞成綠色，死的靶細(xì)胞成紅色和綠色，從而檢測細(xì)胞毒性作用。

CFSE/7-AAD雙染細(xì)胞毒性檢測試劑盒根據(jù)不同的實驗方案設(shè)計，可以用來檢測化合物的細(xì)胞毒性作用。也可以用來檢測殺傷性T 細(xì)胞或NK 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。

CFDA-SE是一種可對活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的新型染料，可以標(biāo)記活體細(xì)胞。CFDASE是一種帶有琥珀酰亞胺(NHS)的熒光染料，可以結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。CFDASE在結(jié)構(gòu)上將酚羥基部位改造成AM 體，所以自身不發(fā)熒光，熒光背景低，脂溶性高，能夠輕易穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的CFDASE的AM部位能被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解生成CFSE，通過共價結(jié)合賴氨酸側(cè)鏈的氨基而摻入細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞表面的蛋白，且結(jié)合后發(fā)出強(qiáng)的綠色熒光。CFSE的琥珀酰亞胺(NHS)和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的氨基部位結(jié)合，固定在細(xì)胞內(nèi)，不會漏出細(xì)胞外。CFSE進(jìn)入細(xì)胞后定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，在細(xì)胞核的熒光最強(qiáng)。

CFSE毒性小，不影響細(xì)胞的增殖能力。此方法操作簡單，且不用放射性同位素，不存在安全隱患。可以更快速，更準(zhǔn)確和更安全地得到想要的實驗數(shù)據(jù)。

CFSE/7-AAD標(biāo)記細(xì)胞后通常用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測。

一般試劑盒采用PI與CFSE 聯(lián)用，但是由于PI的發(fā)射波長是<625nm,通常在FL2中檢測,對CFSE 的干擾大。而且由于波譜較寬，同時在FL3中也能測，所以用了PI 最多再加一個CFSE，F(xiàn)L3就沒法用了。PI還有一個重要的缺點是不容易清洗干凈,使用后清洗流式細(xì)胞儀更加費(fèi)時費(fèi)物。

7-AAD/CFSE試劑盒有效的解決了這些弊端，7-AAD的發(fā)射波長是650nm,只占用FL3通道進(jìn)行檢測，F(xiàn)ITC、PE 兩個通道受影響都小，可以做三色分析。

CFSE標(biāo)記細(xì)胞呈綠色熒光，熒光波長：λex=496 nm,λem=516 nm。流式檢測時的激發(fā)波長可以選擇488nm，此時的發(fā)射波長為516nm，使用流式細(xì)胞儀檢測時可以采用FL1 detection channel。7-AAD 標(biāo)記細(xì)胞呈紅色熒光，流式檢測時的激發(fā)波長可以選擇488nm，此時的發(fā)射波長為650nm，使用流式細(xì)胞儀檢測時可以采用FL3 detection channel。

CFSE標(biāo)記的細(xì)胞除了流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞毒性外，還可單染后用于細(xì)胞增殖檢測，或者用熒光酶標(biāo)板定量活細(xì)胞數(shù)目，或者用熒光顯微鏡進(jìn)行均一染色的細(xì)胞示蹤觀察。

檢測方法：

● 熒光顯微鏡 ● 流式細(xì)胞儀 ● 激光共聚焦

樣本類型：

● 懸浮細(xì)胞 ● 貼壁細(xì)胞

試劑盒以外自備試劑和儀器:

● 流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡或激光共聚焦 ● 離心機(jī) ● CO₂培養(yǎng)箱 ● PBS或者HBSS（不含酚紅） ● 熒光專用黑色96孔板

使用注意事項：

● 旋帽離心管裝試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

● 染色濃度根據(jù)細(xì)胞種類的不同和每孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的多少而異。

● CFSE母液極易水解，建議分裝保存，分裝后用封口膜密封管口，再用錫箔紙包裹，最后和干燥劑一起用塑料袋密封，≦-20℃冷凍保存。

● 冬天氣溫較低時CFSE溶解液會凝固，可先在37℃水浴至溶解液完全融解后再進(jìn)行配制，配制過程中注意避免溶液凝固，保持溫度至CFSE溶解完全。

● CFSE工作液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，不能提前配制，因為CFSE吸水會分解，影響染色效果。

● CFSE易被水解，在水溶液中會很快變質(zhì)。母液請在使用過程中避免接觸水。工作液在標(biāo)記細(xì)胞的過程中和水接觸是在許可的時間范圍內(nèi)的。

● CFSE標(biāo)記細(xì)胞僅需5-15分鐘即可完成。對于不同細(xì)胞，最佳標(biāo)記時間需自行摸索。正式實驗前，建議先做幾個孔摸索染色濃度和加入CFSE試劑后的培養(yǎng)時間。

● 熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

● 以下實驗步驟僅供參考，請根據(jù)實際的實驗方案設(shè)計或參考相關(guān)文獻(xiàn)為準(zhǔn)。

● 必須設(shè)置全陰，CFSE單標(biāo)，7-AAD單標(biāo)的靶細(xì)胞的參照以設(shè)置流式。

使用方法：

CFSE/7-AAD雙染細(xì)胞毒性檢測試劑盒細(xì)胞CFSE染色：

1.根據(jù)需要檢測的細(xì)胞樣品數(shù)，用HBSS將CFSE母液200～4000倍稀釋，配制成CFSE染色工作液。不同的細(xì)胞需要根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果確定最佳染色濃度。如果熒光強(qiáng)度弱，可以適當(dāng)提高CFSE的終濃度。如果背景太高，可以適當(dāng)降低CFSE的終濃度，請摸索條件找到最佳濃度。

【注】：

● 也可以用HBSS等緩沖液或相應(yīng)的無血清培養(yǎng)基稀釋染料母液至所需濃度。

● 開始實驗前，使用HBSS緩沖液或培養(yǎng)基稀釋CFSE到需要的工作濃度。工作濃度為根據(jù)不同細(xì)胞的預(yù)實驗結(jié)果確定的最佳工作濃度，一般染色終濃度200～4000倍稀釋。

● 一般起始濃度按500～1000倍稀釋即可。

● 為了降低過度加載染料導(dǎo)致的潛在背景和細(xì)胞毒性，在不影響實驗結(jié)果的前提下應(yīng)盡可能低濃度染色。

● 工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.將培養(yǎng)好的待測靶細(xì)胞消化后收集，用PBS洗滌2次。

【注】：

● 400×g離心5分鐘。

3.將待測細(xì)胞用染色工作液重懸，至細(xì)胞濃度大約10⁷/ml。

4.在37℃培養(yǎng)箱中避光孵育15～30分鐘。

5.加10倍體積的含血清培養(yǎng)基，400×g離心5分鐘。

6.離心后去上清，收集細(xì)胞，用HBSS或無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1～2次，最后加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

7.在37℃培養(yǎng)箱中孵育20～30分鐘。

細(xì)胞模型制備：

1.收集待檢測的靶細(xì)胞。

2.進(jìn)行相應(yīng)的毒性藥物處理或者效應(yīng)細(xì)胞處理。

【注】：

● 效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞比例根據(jù)需要自行設(shè)定。常見比例如6.25：1；12.5：1；25：1等。

● 活的靶細(xì)胞成綠色；死的靶細(xì)胞成紅色和綠色；死的效應(yīng)細(xì)胞成紅色，活的效應(yīng)細(xì)胞成無色。

細(xì)胞檢測：

1.收集制備好的毒性處理過的細(xì)胞模型。

2.用200μL HBSS重懸細(xì)胞，加入1μL 7-AAD染色液，混勻。

【注】：

● 微量的染色液注意有效的加入細(xì)胞懸液并充分混勻。

● 可以根據(jù)預(yù)實驗確定的染色液濃度，直接用7-AAD和HBSS緩沖液配制成染色工作液，并用染色工作液重懸細(xì)胞。

3.在2～8℃避光孵育10～60分鐘。

4.在400×g離心5分鐘收集細(xì)胞。

5.用500μL HBSS或PBS重懸細(xì)胞。

6.取500μL細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測。

7.根據(jù)流式結(jié)果計算死亡細(xì)胞百分率。被殺傷死亡的靶細(xì)胞被7-AAD染上會出現(xiàn)在CFSE+7-AAD+區(qū)域，未殺傷的在CFSE+7-AAD-區(qū)域，得出被殺傷的靶細(xì)胞的比例。用這個比例再計算毒性。