切片樣本的活性氧檢測一般最好使用振動切片或者新鮮的冰凍切片樣本。石蠟切片樣本的ROS在石蠟切片的的制作過程中會損失掉，有條件的話就使用振動切片或者冰凍切片樣本，一般不建議使用石蠟切片樣本。已經(jīng)制備好的石蠟切片樣本中殘余的ROS也可以用本試劑盒檢測。有條件的話也可以采用直接用新鮮組織樣本檢測，不需要制備成切...

冰凍切片活性氧(ROS)檢測試劑盒

 

產(chǎn)品編號：HR8823

產(chǎn)品組成：

儲存條件：

探針-20℃避光保存；清洗液2-8℃保存。有效期1年。

【注】：

● 探針長期不用可以-20℃保存。避免反復(fù)凍融。

● 探針液A為DMSO溶液，冬季氣溫較低時為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱融解，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。

● 可以用手捂住使其融解或37℃短時間水浴。吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。

冰凍切片活性氧(ROS)檢測試劑盒產(chǎn)品簡介：

組織切片活性氧檢測試劑盒是一種利用熒光探針O11進(jìn)行活性氧檢測的試劑盒。

O11是一種細(xì)胞膜通透性的熒光探針，O11本身熒光極低，被活性氧特異性氧化生成綠色熒光物質(zhì)，綠色熒光強(qiáng)度與活性氧水平成正比，檢測綠色熒光強(qiáng)度就可以知道組織內(nèi)活性氧的水平。

在激發(fā)波長500nm，發(fā)射波長525nm附近，使用激光共聚焦/熒光顯微鏡檢測綠色熒光強(qiáng)度，從而測定組織內(nèi)活性氧水平。利用本試劑盒可以快速定性檢測樣本內(nèi)活性氧水平變化差異。

切片樣本的活性氧檢測一般最好使用振動切片或者新鮮的冰凍切片樣本。石蠟切片樣本的ROS在石蠟切片的的制作過程中會損失掉，有條件的話就使用振動切片或者冰凍切片樣本，一般不建議使用石蠟切片樣本。已經(jīng)制備好的石蠟切片樣本中殘余的ROS也可以用本試劑盒檢測。有條件的話也可以采用直接用新鮮組織樣本檢測，不需要制備成切片的ROS檢測試劑盒（相關(guān)產(chǎn)品：HR8835）。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

● 使用方便：可用熒光顯微鏡直接觀察；

● 背景低，靈敏度高；

● 線性范圍寬，使用方便。

檢測方法：

● 熒光顯微鏡 ● 激光共聚焦顯微鏡

樣本類型：

● 新鮮冰凍切片 ● 振動切片 ● 石蠟切片

試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

● 熒光顯微鏡/激光共聚焦顯微鏡 ● 移液器 ● PBS緩沖液或HBSS(無酚紅)

使用注意事項(xiàng)：

● 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體灑落。

● 盡量縮短探針標(biāo)記后到測定所用的時間，以減少各種可能的誤差。

● 對于某些樣本，如果熒光太強(qiáng)，可以按照1:200-1:1000 稀釋探針。探針標(biāo)記的時間也可以根據(jù)情況在20-60分鐘內(nèi)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整。

● 冰凍切片制作不需要經(jīng)過固定脫水包埋等步驟，直接冷凍后切片貼片。

● 有條件也可采用振動切片的方法。有些方便處理的樣品類型也可采用徒手切片。

● 以下操作步驟僅供參考，請根據(jù)實(shí)際樣本情況調(diào)整。

冰凍切片活性氧(ROS)檢測試劑盒使用方法：

一、 試劑配制

1、根據(jù)樣本數(shù)，用純水將O11活性氧熒光探針200倍稀釋，配成染色工作液。

【注】：

● 不可以一次性將探針全部稀釋。現(xiàn)配現(xiàn)用。

● 不同樣本的ROS差異較大，需要根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整探針用量。一般染色終濃度按試劑盒中探針母液的200-1000倍稀釋，200倍稀釋適合大多數(shù)樣本。

● 如果熒光強(qiáng)度太強(qiáng)，可以增加稀釋倍數(shù)。

● O11探針液為DMSO溶液，冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。

● 微量操作時，注意探針要有效加入勻漿液，避免沒有加入。

● 以下步驟使用的O11探針為此步驟稀釋過的探針。

2、用純水將10×清洗液10倍稀釋，配成1×清洗液工作液。

二、 探針標(biāo)記

1、準(zhǔn)備待測的厚為10-20μm的未經(jīng)固定處理的冰凍切片。

【注】：

● 必須使用新鮮組織（手術(shù)切除后1小時內(nèi)）制成的冰凍切片/振動切片。

● 否則不新鮮的樣本可能ROS已經(jīng)流失，檢測不到活性氧。

● 非新鮮樣本殘余的ROS也可以檢測到。

2、室溫下，小心加上200μL清洗液工作液，鋪滿整個切片表面，靜置5-10 分鐘。

3、小心吸除清洗液。

4、滴加100μL染色工作液，在37℃培養(yǎng)箱避光孵育20-60分鐘。

【注】：

● 最好在濕盒中孵育，避免液體蒸發(fā)。

5、移除染色液。

6、用PBS洗滌切片2-3次。

7、加蓋玻片或甘油封片。

8、熒光顯微鏡檢測。

【注】：

● 染色完成后，立即進(jìn)行熒光定性分析。

● 激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm。

● 熒光強(qiáng)，表明活性氧（ROS）含量高。

● 拍照后，用相應(yīng)的圖像分析軟件進(jìn)行光密度分析?？梢杂脤?shí)驗(yàn)中對照樣本的熒光強(qiáng)度值為基準(zhǔn)，待測組樣本的熒光強(qiáng)度值占對照樣本的百分比來比較活性氧（ROS）程度差異。

常見問題分析：

● 活性氧結(jié)果如何分析？

ROS是多種物質(zhì)的統(tǒng)稱，不像某一單一活性氧指標(biāo)，無法檢測其絕對的含量，只能通過設(shè)置參照樣本，以參照樣本的倍數(shù)來反映目標(biāo)樣本相對含量變化，這個“相對”是針對參照的。分析結(jié)果是定性的，也是沒有單位的，因?yàn)樗举|(zhì)上是一個比值（目標(biāo)/參照）。反映的是模型樣本通過具體的干預(yù)措施（如養(yǎng)分缺失、缺氧、藥物治療或遺傳基因操控等）如何影響其ROS的變化，測定其ROS是增加或者降低了。

● 熒光照片如何分析？

需要有相關(guān)的熒光強(qiáng)度分析軟件。ROS表達(dá)水平直接通過熒光信號的強(qiáng)弱和分布范圍來體現(xiàn)。

有的顯微鏡掃描下來的圖像本身就可以測面積和強(qiáng)度，可以同時測不同顏色的熒光強(qiáng)度。有的顯微鏡不支持此功能，可以將熒光染色彩色圖像轉(zhuǎn)換為黑白的灰度圖，然后再以灰度值作為測量指標(biāo)進(jìn)行分析。

要結(jié)合明場的照片具體分析。如果細(xì)胞分布均勻可以算固定面積熒光強(qiáng)度。成像時中心和四周有差異時，一般將四周剪切掉也可以。如果細(xì)胞分布不勻，需要找到細(xì)胞分布勻稱的視野，一個視野一個視野找。

如果要用圖片做結(jié)果，就要平行做多個圖片，作分析，統(tǒng)計(jì)，每張都要求熒光分布盡量一致。

為了去除雜光的影響，可以適當(dāng)調(diào)節(jié)統(tǒng)計(jì)熒光的強(qiáng)度范圍，將信號過弱的背景雜光去除掉。對照組和實(shí)驗(yàn)組整張圖片需要做同樣的處理，保證所有參數(shù)均要一致。

對于不同情況熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)方法，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要或參考文獻(xiàn)。可以算等面積的平均強(qiáng)度；也可以算閾值高于一定值的平均強(qiáng)度；也可以算熒光的累積而不算平均。

要根據(jù)課題需要選擇合適的測量統(tǒng)計(jì)方法。

● 熒光照片效果不好？

熒光拍照存在很多變量，每一個變量都會嚴(yán)重影響拍照效果。

熒光拍攝條件：拍攝環(huán)境、顯微鏡品牌和激發(fā)熒光決定了鏡下觀察的效果。同樣的操作方法和切片，在不同品牌顯微鏡下顯示出完全不同的熒光強(qiáng)度。

熒光衰減：熒光物質(zhì)的衰減通常都是非常明顯的。同樣的一組切片，1小時內(nèi)拍攝和8小時后拍攝，熒光效果完全不同。

最好用激光共聚焦顯微鏡，激光共聚焦顯微鏡的分辨率比普通熒光顯微鏡要高的多，通常同一張片子激光共聚焦的效果明顯更優(yōu)。

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