細胞氧氣消耗檢測試劑盒可以用于直接,實時分析細胞呼吸和線粒體功能。本試劑盒可以用來測量各種全細胞（貼壁和懸浮細胞）,透化細胞,各種3D培養(yǎng)物,組織,小生物,球體,支架和基質(zhì)等。還適用于分離的線粒體,分離的酶,細菌,酵母和霉菌等的細胞外耗氧情況測量。...

細胞耗氧率檢測試劑盒

 

產(chǎn)品編號：HR8262

產(chǎn)品組成：

儲存條件：

探針-20℃密封避光(避免反復(fù)凍融,防止氧化)；試劑B室溫保存。有效期6個月。

細胞耗氧率檢測試劑盒產(chǎn)品說明：

本產(chǎn)品是利用我公司合成的特異性氧氣熒光探針R01來檢測細胞外耗氧情況變化的試劑盒?？梢酝ㄟ^簡單的混合基于熒光酶標儀便捷的直接進行耗氧量測定。

R01耗氧量分析可實時測量全細胞或分離線粒體的耗氧量,是以高通量形式來評估用于代謝表征的細胞呼吸以及評估治療對線粒體功能毒性作用的一種可靠方法。

它可以使用熒光酶標儀在標準微孔板上進行有氧代謝的簡單動力學測定。隨著呼吸作用的進行,溶解氧被消耗,樣品中的氧氣濃度降低,導致R01分析的信號增加,從而實現(xiàn)對耗氧量的測定。

R01是氧氣敏感的熒光探針,最大激發(fā)波長為468nm,最大發(fā)射波長為603nm。其熒光通過分子碰撞與氧氣反應(yīng),由O₂淬滅,在無氧條件下熒光強度更高,反之有氧條件下熒光強度變低,因此熒光信號的量與樣品中細胞外O₂的量成反比,從而R01可被用于監(jiān)測細胞外氧氣消耗的變化。在測定中,耗氧量由熒光信號隨時間的變化計算。細胞耗氧量增加,熒光信號的變化率增加；反之,耗氧量減少,熒光信號的變化率降低。

R01與O₂的這種反應(yīng)是非破壞性且完全可逆的,R01無細胞毒性,是化學穩(wěn)定的,惰性的,水溶性的和細胞不滲透的,不能透過完整的細胞膜。因此還可同時與糖酵解,線粒體膜電位JC-1,ROS和細胞ATP、LDH等檢測的試劑結(jié)合使用,進行多參數(shù)檢測。

用R01進行細胞外耗氧檢測方法及其簡單,不需要適用特殊的儀器設(shè)備,只需要熒光酶標儀之類的熒光讀板設(shè)備即可。

細胞氧氣消耗檢測試劑盒可以用于直接,實時分析細胞呼吸和線粒體功能。本試劑盒可以用來測量各種全細胞（貼壁和懸浮細胞）,透化細胞,各種3D培養(yǎng)物,組織,小生物,球體,支架和基質(zhì)等。還適用于分離的線粒體,分離的酶,細菌,酵母和霉菌等的細胞外耗氧情況測量。

以96孔細胞培養(yǎng)板計,本試劑盒小包裝可以檢測200個樣本。

產(chǎn)品特點：

● 廣泛適用于各種體外模型；不再局限于單層細胞,還能測定懸浮細胞、微生物和特定的3D培養(yǎng)物；

● 簡單的“混合-檢測”方案允許使用多種其他分析試劑盒進行多參數(shù)分析；

● 可逆轉(zhuǎn),能夠觀察耗氧量的瞬態(tài)和長時間變化；

● 可適配多種熒光酶標儀以及標準96孔和384孔；

● 以高通量的形式方便地測量；

● 無需等待專用設(shè)備空閑所需的實驗室時間,也無需大額資金專用設(shè)備投入。

產(chǎn)品用途：

● 線粒體功能和細胞代謝研究；

● 測量活細胞中的線粒體活性；

● 研究各種處理對細胞耗氧量的影響；

● 研究基因修飾對細胞耗氧量的影響；

● 研究呼吸和線粒體功能；

● 探究氧含量與細胞代謝變化之間的聯(lián)系；

● 直接評估藥物處理的線粒體毒性。

適用樣本類型：

● 細胞：貼壁細胞/懸浮細胞/透化細胞；

● 分離的線粒體；

● 3D培養(yǎng)物；組織；

● 分離的酶；

● 微生物：細菌/酵母/霉菌。

熒光檢測模式：

● 基礎(chǔ)模式：熒光強度測定；

● 標準模式：時間分辨熒光測量（TR-F）；

● 高級模式：熒光Lifetime calculation（FLIM,Autofluorescence Lifetime Imaging system,Dual-read Ratiometric TR-F measurement）

【注】：

● 以上取決于酶標儀的類型和儀器設(shè)置,不是所有儀器可用。

試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

● 熒光酶標儀（須配備相應(yīng)的波長過濾器和溫度控制器。時間分辨熒光功能的讀板機佳（如果有）） ● 離心機 ● PBS/HBSS（無酚紅） ● 對照試劑（選配,非必須）：Glucose Oxidase,Antimycin A,FCCP ● 黑色透明底熒光專用培養(yǎng)板

細胞耗氧率檢測試劑盒使用注意事項：

● 螺旋蓋微量管裝試劑在開蓋前請短暫離心,將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底,避免開蓋時液體灑落。

● 細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。

● 以下操作以96孔細胞培養(yǎng)板為例。其他培養(yǎng)容器或裝置請根據(jù)實際情況調(diào)整試劑用量和檢測方法。各試劑等比例調(diào)整即可。O₂熒光探針終濃度25倍稀釋最佳。
● R01探針的信號變化直接取決于所測量細胞類型的細胞呼吸速率,建議盡可能使用每孔高的細胞密度作為起點,并根據(jù)需要減少細胞數(shù)量。

● 并非所有細胞類型都消耗足夠用于檢測的氧氣。

● 必須用熒光培養(yǎng)專用的透明底黑色培養(yǎng)板,減少檢測時各孔之間的光互相干擾。

● 用于測定的所有儀器試劑溶液耗材均需37℃預(yù)熱。

● 添加氧氣封閉液時注意避免產(chǎn)生氣泡。

● 盡可能使用多通道移液器添加試劑。

● 如果藥物有紅色熒光（如阿霉素等）需要換液,不含培養(yǎng)基和待測藥物,用HBSS貨PBS體系檢測,在無血清無酚紅環(huán)境檢測。

● 建議設(shè)定FCCP處理的陽性對照樣本。

關(guān)于儀器設(shè)置：

● 溫度對檢測有較大影響。有條件的話,務(wù)必使用配有溫度控制的酶標儀。

● 常規(guī)的熒光信號強度測量,使用基于單色儀或基于過濾器的酶標儀,最佳激發(fā)波長使用450-460nm,發(fā)射波長使用586-600nm?？筛鶕?jù)實際機器和樣本選擇信號最強的波長。

● 具有檢測增益參數(shù)（PMT,Parameters）的通常設(shè)置為中或高。

● 使用bottom read讀數(shù)和top read讀數(shù)均可,基于不同的細胞模型,建議在預(yù)實驗時兩種讀數(shù)模式均嘗試下,看哪種的趨勢更加明顯。

關(guān)于氧氣封閉液使用：

● 氧氣封閉液可以用移液器吸取添加,添加時需要沿著培養(yǎng)板壁慢慢加入,使其順板壁向下流到培養(yǎng)基表面。

● 也可以直接用滴瓶滴加,倒轉(zhuǎn)預(yù)熱的滴管瓶并輕輕施加壓力,使封閉液足以充注瓶尖。每個孔滴兩滴,使每個液滴在孔側(cè)面順應(yīng)向下流到培養(yǎng)基表面。

● 使用移液器添加封閉液時,可將黃色吸頭的嘴部用鋒利的刀片或剪刀修剪處理。將豎直吸頭離尖端3-4mm 處45°角修剪處理。

● 取下滴管瓶內(nèi)嘴蓋,輕輕吸取預(yù)熱的氧氣封閉液。避免上下吹吸形成氣泡。

關(guān)于細胞培養(yǎng)：

● 對于貼壁細胞,在200μL培養(yǎng)基中的96孔板中接種細胞。在37℃的CO₂培養(yǎng)箱中孵育過夜。

● 對于懸浮細胞,在檢測當天在100μL培養(yǎng)基中接種。

● 注意所需的接種密度取決于細胞類型。 我們推薦進行細胞接種密度預(yù)實驗以確定最佳密度。通常從高細胞密度（通常為60,000）開始,每孔的最佳細胞數(shù)一般為：貼壁細胞每孔80,000個細胞,懸浮細胞每孔5-6×10⁵（96 孔板）。

● 檢測待測樣品都設(shè)置3復(fù)孔。

● 注意始終每96孔板留出至少6個孔,以免添加細胞作為空白對照和信號控制孔。

關(guān)于對照孔設(shè)置：

● 一般空白孔要設(shè)置,其它對照根據(jù)實驗需要決定。

● （推薦對照設(shè)置,以下可選,非必須）：

空白對照：	保留兩個或三個孔,使其不添加細胞以用作空白對照。 向每個孔中添加100μL新鮮培養(yǎng)基。 （不要在這些孔中添加R01氧熒光探針）
無細胞陰性對照：	使兩孔或三孔沒有細胞添加用作無細胞陰性對照。 加入100μL 新鮮培養(yǎng)基+ 4μL R01氧熒光探針。
無細胞陽性對照：	使兩孔或三孔沒有細胞添加用作無細胞陽性對照。 加入90μL新鮮培養(yǎng)基+ 10μL（1mg/mL）葡萄糖氧化酶（水溶液）+ 4μL R01氧熒光探針試劑。 如果讀板器設(shè)置正確,則這些孔將顯示出熒光強度/壽命的快速增加,這表明葡萄糖氧化酶活性引起的耗氧。
有細胞陰性對照：	向包含細胞的兩個或三個孔中加入1μL（100μM）抗霉素A儲備溶液+ 4μL R01氧熒光探針試劑。 抑制劑抗霉素A 將抑制由線粒體呼吸引起的氧氣消耗。
*有細胞陽性對照：	向包含細胞的兩個或三個孔中加入1μL（0.1-5 mM）FCCP儲備溶液+ 4μL R01 氧熒光探針試劑。 激活劑FCCP將顯著提高細胞呼吸的氧氣消耗。 【注】： ● 如果使用FCCP處理,必須進行劑量測試,因為細胞對FCCP呈現(xiàn)鐘形響應(yīng)

使用方法：

1. 準備細胞模型。

【注】：

● 根據(jù)自己實驗需要設(shè)計相應(yīng)方案,準備待測試化合物。

● 注意設(shè)置對照孔,復(fù)孔等。

● 建議始終使用至少兩個沒有細胞的孔作為空白對照孔（不要在這些孔中添加R01氧熒光探針）和至少兩個其他無細胞的孔作為無細胞陰性對照孔。還可以考慮設(shè)置無細胞陽性對照,如前“推薦對照”中所述。

2. 培養(yǎng)好的待檢測細胞移除培養(yǎng)基,用PBS洗滌細胞。

3. 加入100μL新鮮培養(yǎng)基。

【注】：

● 以96孔板為例。

4. 加入4μL R01氧熒光探針,充分混勻。

5. （可選）可以在此處添加待測試化合物（通常為1-10μL）（如果需要的話）。

【注】：

● 建議將添加的化合物的量保持在較低水平,以最大程度地減少溶劑的潛在影響。

6. 每孔加入100μL氧氣封閉液。

【注】：

● 建議用移液器準確吸取,也可以直接用滴瓶滴加2滴。

● 需要沿著培養(yǎng)板壁慢慢加入,不要伸到培養(yǎng)基液面下快速加入。

● 注意避免產(chǎn)生氣泡。

● 封閉液量的微小變化（在90-110μL之間）對檢測沒有不利影響。

7. 然后用該細胞板進行熒光細胞外O₂消耗變化情況檢測。

激發(fā)波長455-468nm,發(fā)射波長603nm。測定熒光強度,每2分鐘或3分鐘讀取一次。

【注】：

● 熒光強度隨著細胞外O₂消耗增加。

● 熒光檢測需要使用熒光專用的透明底黑色培養(yǎng)板。

● 有些細胞模型剛開始檢測的一小段時間內(nèi)可能出現(xiàn)熒光強度下降的情況,一般10分鐘左右?？梢缘葻晒馄胶夂箝_始上升的時間點作為起點。

8. 繪制耗氧率曲線。

【注】：

● 熒光強度值經(jīng)空白對照校正。

9. 計算每個樣品的斜率值。

【注】：

● 注意選擇每個信號曲線的線性部分,避開起始的滯后數(shù)據(jù),避開后期的平穩(wěn)期。

● 線性回歸確定每孔的斜率（OCR耗氧率）。

● 計算重復(fù)孔之間的平均值。

● （選做）如果需要,可以從所有測試值中減去無細胞陰性對照樣品或基于細胞的陰性對照樣品獲得的斜率。

結(jié)果示例：

1. 斜率曲線獲得

 

 

 

 

 

 

 

 

2. 繪制劑量反應(yīng)曲線

要生成劑量響應(yīng)曲線,繪制計算的耗氧率（OCR）與生成如上OCR曲線的數(shù)據(jù)對應(yīng)的化合物濃度的關(guān)系曲線,如下：OCR與藥物濃度的關(guān)系證明抗霉素A引起對細胞呼吸的抑制反應(yīng)。

 

 

 

 

 

 

 

常見問題分析：

● 耗氧率檢測趨勢跟預(yù)期的不一致？

檢查細胞接種和移液的一致性。

增加細胞密度。

將測定體積減少到60μL。

在某些較短檢測時間區(qū)間內(nèi),會出現(xiàn)熒光數(shù)據(jù)的波動情況,出現(xiàn)斜率下降或不變化,需要擴大到更長的時間范圍內(nèi)來分析耗氧率趨勢。一般檢測時間范圍不少于30分鐘。

溫度對檢測有較大影響。有條件的話,務(wù)必使用配有溫度控制的酶標儀,儀器以及所有培養(yǎng)基和儲備溶液均須使用前37℃預(yù)熱。注意某些讀板器的溫度控制不一致,如果存在這種情況,請考慮將測定和平衡溫度降低到30℃,避開外圈。

● 使用的細胞類型靈敏度不夠？

可以考慮以下改善方案：

增加酶標儀的增益（PMT）設(shè)置。

在無酚紅或無血清的情況下測定。

增加R01氧熒光探針的體積（至少10μL/孔）。

減少R01氧熒光探針的體積（至2μL/孔）

增加細胞密度。

將測定體積減少到60μL。

測量底部讀數(shù)（如果有）。

調(diào)整TR-F焦距。

● 我無法在含有細胞的孔中檢測到任何信號,或者我可以檢測到信號,但斜率（速率）顯得很低？

檢查正確的儀器設(shè)置,設(shè)置信號優(yōu)化。

增加細胞密度。

將測定體積減少到60μL。

● 開始測定時熒光強度出現(xiàn)下降趨勢？

有些細胞模型樣本剛開始測定的一小段時間內(nèi)可能出現(xiàn)熒光強度下降的情況,一般10分鐘左右,可以等熒光平衡后開始上升的時間點作為起點。

附 錄

實驗數(shù)據(jù)分析方法

產(chǎn)品說明：

細胞氧氣消耗檢測試劑盒是利用合成的特異性氧氣熒光探針R01來檢測細胞外耗氧情況變化的試劑盒。

R01是氧氣敏感的熒光探針,最大激發(fā)波長為 468 nm,最大發(fā)射波長為603 nm。其熒光通過分子碰撞與氧氣反應(yīng),由O₂淬滅,在無氧條件下熒光強度更高,反之有氧條件下熒光強度變低,因此熒光信號的量與樣品中細胞外O₂的量成反比,從而R01可被用于監(jiān)測細胞外氧氣消耗的變化。在測定中,耗氧量由熒光信號隨時間的變化計算。

細胞活動的代謝效應(yīng)可以通過分析R01熒光信號的變化率來評估,變化率低表明有氧代謝活動減少,耗氧量減少；反之,變化率高表明有氧代謝活動增加,細胞耗氧量增加。

應(yīng)用實例

一：細胞氧氣消耗率（OCR）的測定

二：藥物濃度與細胞耗氧率的量效關(guān)系測定

三：分離的線粒體的呼吸測定

四：耗氧率與線粒體膜電位（MMP）雙重分析

五：耗氧率與細胞活性雙重分析

應(yīng)用實例一：

細胞氧氣消耗率（OCR）的分析：

利用R01分析研究HepG2細胞的耗氧量。在用解偶聯(lián)劑FCCP處理的細胞中,由于呼吸作用增加,信號變化率也隨之增加。相反,用線粒體呼吸抑制劑抗霉素A處理則產(chǎn)生了相反的效果。由于耗氧量減少,信號變化率也降低。

這類測定可以在多種培養(yǎng)基中進行,可以根據(jù)需要進行靈活的實驗分析設(shè)計。

材料和試劑：

● HepG2 細胞 ● FCCP ● Antimycin A ● 待測化合物 ● HBSS等

實驗步驟：

1. 培養(yǎng)HepG2細胞

2. 藥物處理細胞。

3. 測定熒光。

實驗結(jié)果：

圖一（A）：

用調(diào)節(jié)線粒體功能的化合物處理后的細胞的R01典型熒光信號曲線：

抗霉素A（線粒體呼吸抑制劑）處理抑制了氧消耗,因此,探針信號變化率也隨之減小。使用FCCP（解偶聯(lián)劑）處理時耗氧量增加,探針信號變化率也隨之增加。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

細胞呼吸消耗溶解氧,降低了細胞外O₂含量,導致R01試劑熒光信號增加。增加的速率反映出了O₂消耗速率。抑制劑（Antimycin A）和藥物影響電子傳遞鏈,抑制了細胞呼吸,而解偶聯(lián)劑（FCCP）能促使呼吸作用達到最大速率。劑量響應(yīng)曲線顯示出良好的分析間重現(xiàn)性。

圖一（B）：相對細胞耗氧率：

以上的代謝效應(yīng)可以通過分析R01試劑信號的變化率來評估,變化率低表明有氧代謝活動減少。經(jīng)調(diào)控耗氧率（OCR）的化合物處理后的HepG2細胞的細胞代謝通量,以相對于未經(jīng)處理的對照細胞的百分比表示。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

應(yīng)用實例二：

用于毒理學的R01解決方案,藥物濃度與細胞耗氧率的量效關(guān)系：

藥源性線粒體功能障礙與多種藥物類別有關(guān),并且研究證明其可顯著引起肝臟、心臟、腎臟、肌肉和中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性。

得益于微孔板形式和分析性能,R01分析為藥源性線粒體影響的早期篩選以及生成劑量-響應(yīng)曲線提供了一種方便的解決方案（圖2）。這些研究可采用一系列相關(guān)的體外模型進行,包括原代肝細胞和hiPSC衍生的心肌細胞和肝細胞。

材料和試劑：

● 心肌細胞 ● Nifedipine ● HBSS等

實驗步驟：

1. 培養(yǎng)心肌細胞

2. 藥物處理細胞。

3. 測定熒光。

實驗結(jié)果：

圖二：分析藥源性細胞毒性：

利用R01分析測定Nifedipine對心肌細胞心肌細胞線粒體呼吸的劑量-響應(yīng)曲線。這些值由斜率OCR與對照細胞進行歸一化處理得到。

 

 

 

 

 

 

 

 

應(yīng)用實例三：

測量分離的線粒體的呼吸：利用R01,能更容易地測量分離的線粒體的呼吸。該分析能夠在常規(guī)熒光酶標儀上進行,可基于微孔板直接進行方便、高通量的電子傳遞鏈(ETC)活性評估(圖3A)。這有利于更方便地進行化合物篩選和劑量-響應(yīng)分析（圖3B）。

此外,利用特定的底物和抑制劑組合,可以對單個ETC復(fù)合體和相關(guān)的線粒體蛋白進行更詳細的機制評估。與傳統(tǒng)的極譜法相比,R01分析所需的樣品量相對較少,每次分離可以進行更多的重復(fù)分析。低樣品量需求顯著增加了由單次線粒體處理可獲得的數(shù)據(jù)量,尤其是在使用 384 孔板時。

材料和試劑：

● 大鼠肝臟組織 ● 線粒體分離試劑盒 ● FCCP ● 待測化合物 ● HBSS等

實驗步驟：

1. 分離線粒體

2. 藥物處理線粒體。

3. 測定熒光。

實驗結(jié)果：

圖三（A）：分析藥源性細胞毒性：

使用R01分析得到的分離線粒體（大鼠肝臟）的呼吸分析結(jié)果 (A) 顯示了用經(jīng)典的線粒體功能調(diào)節(jié)劑處理后的抑制和解偶聯(lián)作用。

 

 

 

 

 

 

 

 

圖三（B）：分析藥源性細胞毒性：

使用大鼠肝臟線粒體篩選一組未知藥物以鑒定藥源性線粒體功能障礙（藥物2和6）。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

應(yīng)用實例四：

線粒體功能的多參數(shù)和多重評估：

耗氧率（OCR）與線粒體膜電位（MMP）雙重分析：

通過將R01分析與其他相關(guān)酶標儀兼容參數(shù)（例如,線粒體膜電位(MMP)、活性氧 (ROS) 或細胞ATP含量）的測定相結(jié)合,可以實現(xiàn)對細胞反應(yīng)的進一步了解。這樣一來,研究人員能夠更好地研究各種處理或條件變化對細胞功能的影響。它還有助于將觀察到的代謝干擾情境化,而無需進行平行處理或使用不同的技術(shù)平臺。

在同一孔中進行R01分析信號和JC-1測定。使用Antimycin A或FCCP處理HepG2細胞。兩種化合物均引起MMP降低(A),FCCP引起耗氧量的特征性增加,而Antimycin A則抑制呼吸(B)。

材料和試劑：

● HepG2細胞 ● JC-1線粒體膜電位試劑盒 ● FCCP ● Antimycin A ● HBSS等

實驗步驟：

1. 培養(yǎng)HepG2細胞

2. 藥物處理細胞。

3. 測定熒光。

實驗結(jié)果：

圖四（A）：線粒體膜電位（MMP）

使用 JC-1 線粒體膜電位檢測FCCP 處理、Antimycin A 處理、未處理對照細胞的線粒體膜電位情況。使用FCCP 和Antimycin A處理的細胞均引起 MMP 降低。

 

 

 

 

 

 

 

圖四（B）：耗氧率（OCR）

使用R01分析FCCP處理、Antimycin A處理、未處理對照細胞的OCR。

使用FCCP處理的細胞OCR升高,使用Antimycin A處理的細胞OCR降低。

 

 

 

 

 

 

 

應(yīng)用實例五：

線粒體功能的多參數(shù)和多重評估：

耗氧率（OCR）與細胞活性（Calcein AM熒光法）雙重分析：

利用細胞活力（Calcein AM熒光法）和線粒體呼吸（OCR）的雙重測定,更好地理解

藥物治療對細胞功能的脫靶效應(yīng)（圖5）。

Antimycin A 處理（A）和Tamoxifen 處理（B）24 小時的 HepG2 細胞中的R01分析信號和Calcein AM雙重測定。兩種藥物都能減弱線粒體呼吸（淺紫紅色）。

Tamoxifen對細胞活力表現(xiàn)出顯著影響,而Antimycin A處理并未顯著降低細胞活力（深紫紅色）。這表明,Antimycin A對呼吸的影響是由更直接的線粒體機制引起的。

材料和試劑：

● HepG2細胞 ● 細胞活性檢測試劑盒 ● Tamoxifen ● Antimycin A ● HBSS等

實驗步驟：

1. 培養(yǎng)HepG2細胞

2. 藥物處理細胞。

3. 測定熒光。

實驗結(jié)果：

圖五（A）：抗霉素 A 處理

Antimycin A 處理的細胞OCR 明顯降低（●）,細胞活力未顯著降低（■）。

Antimycin A 對呼吸的影響是由直接的線粒體機制引起。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

圖五（B）：Tamoxifen 處理

Tamoxifen 處理的細胞OCR 明顯降低（●）,細胞活力明顯降低（■）。

Tamoxifen 對呼吸的影響不是由直接的線粒體機制引起。

 

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