O13 ROS探針在細胞中活性氧存在的條件下，被氧化生成紅色熒光物質，紅色熒光強度與細胞內活性氧水平成正比，檢測O13產物的熒光強度就可以知道細胞內活性氧的水平。本試劑盒中的O13 ROS探針為紅色熒光的活性氧探針，具有510/610nm的最大激發/發射波長。...

活性氧ROS檢測試劑盒-O13，紅色

產品編號：HR9097

產品組成：

活性氧ROS檢測試劑盒-O13，紅色儲存條件：

探針-20℃避光保存，有效期6個月。

【注】：

● 染料長期不用可以-20℃，避免反復凍融。需要長期保存可以根據需要分裝后避光凍存。

● 染色液O13為DMSO溶液，冬季氣溫較低時為凝固狀態，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱融解，變成液體狀態后離心至管底部再開蓋。

● 可以用手捂住使其融解或37℃短時間水浴。吸頭也需要放在培養箱預熱，否則容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。

產品簡介：

O13 ROS探針在細胞中活性氧存在的條件下，被氧化生成紅色熒光物質，紅色熒光強度與細胞內活性氧水平成正比，檢測O13產物的熒光強度就可以知道細胞內活性氧的水平。

本試劑盒中的O13 ROS探針為紅色熒光的活性氧探針，具有510/610nm的最大激發/發射波長。

在激發波長510nm，發射波長610nm附近，使用熒光分光光度計、熒光酶標儀、流式細胞儀、激光共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡等檢測O13產物熒光強度，從而測定細胞內活性氧水平。。

產品特點：

● 使用方便：可用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測或激光共聚焦顯微鏡直接拍照分析；

● 背景低，靈敏度高；

● 線性范圍寬，使用方便。

檢測方法：

● 熒光分光光度計 ● 熒光酶標儀 ● 流式細胞儀 ● 熒光顯微鏡 ● 激光共聚焦

樣本類型：

● 懸浮細胞 ● 貼壁細胞

試劑盒以外自備儀器和試劑耗材：

● 熒光分光光度計或熒光酶標儀，流式細胞儀、激光共聚焦、熒光顯微鏡等激發波長510nm，發射波長610nm。

● 熒光專用黑色96孔板 ● 離心機 ● 移液器 ● PBS緩沖液/HBSS（不含酚紅） ● BCA蛋白定量試劑

使用注意事項：

● 螺旋蓋微量管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體灑落。

● 熒光探針在2-8℃時是固體狀態，從冰箱取出后恢復至室溫，變成液體狀態后離心至管底部再開蓋。

● 本熒光探針在冬季氣溫較低時在室內時為凝固狀態，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要加熱溶解，吸頭也需要放在培養箱預熱，否者容易再次凝固在吸頭內壁產生損耗。

● 使用前，先將本品取出回溫至室溫（20℃以上），并對其進行簡短離心使溶液集中于管底。

● 熒光探針標記后，一定要洗凈殘余的未進入細胞內的探針，否則會導致背景較高。

● 探針標記完畢并洗凈殘余探針后，可以進行激發波長的掃描和發射波長的掃描，以確認探針的標記情況是否正常。

● 盡量縮短探針標記后到測定所用的時間，以減少各種可能的誤差。

● 探針標記的時間也可以根據情況在15-60分鐘內適當進行調整。

● 標記的條件因細胞種類而異，根據不同樣本的實際染色結果做相應調整，在每次實驗前，請先根據不同的實驗要求、細胞類型、細胞的膜通透性等進行優化，確定最佳條件。以下染色操作條件僅供參考。請根據實際樣本情況調整或參考文獻。

● 酚紅對O13熒光探針的檢測有輕微干擾，需盡可能避免。

● 以下步驟僅做為參考，稀釋比例和孵育時間可根據實際情況來調整。比如，對于某些細胞，如果發現未被刺激的陰性對照細胞熒光也比較強，可降低探針濃度。如果發現用感興趣的藥物刺激后熒光較弱，可升高O13探針濃度，以提高檢測的靈敏度。另外，探針裝載的時間也可以根據情況在15-60分鐘內適當進行調整，孵育溫度在4℃-37℃內調整。

● 必須使用熒光檢測專用的黑色96孔板。

活性氧ROS檢測試劑盒-O13，紅色使用方法：

一、探針標記

探針溶液可在新鮮無血清培養基、緩沖鹽溶液中稀釋到所需濃度，1000-10000倍稀釋，以此染色液更換細胞培養基；也可直接向細胞孵育液體中加入探針溶液至所需濃度。

【注】：

● 開始實驗前，使用HBSS緩沖液或無血清培養基稀釋染料儲存液到需要的工作濃度。工作濃度應根據不同細胞的預實驗結果確定的最佳工作濃度，建議至少在超過10倍范圍的濃度下進行測試。一般染色終濃度1000-10000倍稀釋，1000-2000倍適合大多數細胞樣本。

● 建議收到產品后，根據使用量，對母液進行小量分裝，每次使用一管，試劑-20℃避光凍存，一年穩定。

● 工作液現配現用。

依據細胞ROS含量的不同，O13探針終濃度可選擇在1000-10000倍稀釋的范圍，孵育時間可選擇10-90分鐘，在37℃或室溫進行避光孵育。

孵育結束后，用新鮮溶液清洗細胞。

原位標記：僅適用于貼壁培養細胞。

1、按照1:1000-2000用無血清培養基稀釋O13探針。

【注】：

● 不能用含有血清的培養基稀釋O13探針。

● 也可以用HBSS緩沖液稀釋探針。

2、去除細胞培養基，用PBS 洗細胞一次。

3、加入適當體積稀釋好的O13探針。

【注】：

● 加入的體積以能充分蓋住細胞為宜，通常對于6孔板的一個孔加入稀釋好的O13探針工作液不少于1毫升。96孔板加入100-200μL。

● 也可以將細胞置于培養皿中的蓋玻片上，加入合適培養基，使其爬片生長。

4、在37℃細胞培養箱內避光孵育20-40分鐘。

5、用無血清細胞培養液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內的O13探針。

【注】：

● 也可以用HBSS/PBS洗滌細胞。

● 若染色不夠充分，建議增加染料濃度或延長染色時間。

6、加入200μL HBSS緩沖液。

【注】：

● 也可以用PBS/細胞培養基。

7、熒光酶標儀、熒光顯微鏡（含合適濾片）檢測。

收集后標記：懸浮細胞或貼壁細胞消化處理

1、按照1:1000用無血清培養基稀釋O13探針。

【注】：

● 不能用含有血清的培養基稀釋探針。

● 也可以用HBSS緩沖液稀釋探針。

2、離心移除培養基，用PBS洗細胞一次。

3、細胞收集后懸浮于稀釋好的O13探針中，細胞濃度為1×10⁶-2×10⁷/mL，37℃細胞培養箱內避光孵育20-40 分鐘。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。

4、用無血清細胞培養基洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內的O13探針。

【注】：

● 也可以用HBSS/PBS洗滌細胞。

6、用HBSS/PBS/無血清細胞培養基重懸細胞。

7、用熒光光度計、熒光酶標儀、流式細胞儀檢測。

【注】：

● 對于懸浮細胞，也可將細胞貼附于經細胞粘合劑處理過的蓋玻片上，然后使用類似于貼壁細胞的方法進行染色。

● 如果需要蓋玻片上固定化的細胞， 那么可在鋪片前可以先用多聚賴氨酸（poly-D-lysine）包被載玻片或蓋玻片。

● 若染色不夠充分，建議增加染料濃度或延長染色時間。

二、活性氧檢測

1、對于原位標記探針的樣品可以用熒光酶標儀檢測，或者用激光共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡，直接拍照分析（需要有相關的熒光強度分析軟件）。

2、或收集細胞后標記探針然后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。

3、對于收集細胞后標記探針的樣品可以用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，用激光共聚焦顯微鏡直接拍照分析也可以（需要有相關的熒光強度分析軟件）。

4、使用488～535nm激發波長，590nm～610nm發射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。

5、熒光強度強，活性氧含量高。

【注】：

● 如果用顯微鏡拍照分析的話，需要細胞分布均勻。

常見問題分析：

● 活性氧結果如何分析？

ROS是多種物質的統稱，不像某一單一活性氧指標，無法檢測其絕對的含量，只能通過設置參照樣本，以參照樣本的倍數來反映目標樣本相對含量變化，這個“相對”是針對參照的。分析結果是定性的，也是沒有單位的，因為它本質上是一個比值（目標/參照）。反映的是模型樣本通過具體的干預措施（如養分缺失、缺氧、藥物治療或遺傳基因操控等）如何影響其ROS的變化，測定其ROS是增加或者降低了。

● 熒光照片如何分析？

需要有相關的熒光強度分析軟件。ROS表達水平直接通過熒光信號的強弱和分布范圍來體現。

有的顯微鏡掃描下來的圖像本身就可以測面積和強度，可以同時測不同顏色的熒光強度。有的顯微鏡不支持此功能，可以將熒光染色彩色圖像轉換為黑白的灰度圖，然后再以灰度值作為測量指標進行分析。

要結合明場的照片具體分析。如果細胞分布均勻可以算固定面積熒光強度。成像時中心和四周有差異時，一般將四周剪切掉也可以。如果細胞分布不勻，需要找到細胞分布勻稱的視野，一個視野一個視野找。

如果要用圖片做結果，就要平行做多個圖片，作分析，統計，每張都要求熒光分布盡量一致。

為了去除雜光的影響，可以適當調節統計熒光的強度范圍，將信號過弱的背景雜光去除掉。對照組和實驗組整張圖片需要做同樣的處理，保證所有參數均要一致。

對于不同情況熒光強度的統計方法，根據實驗需要或參考文獻。可以算等面積的平均強度；也可以算閾值高于一定值的平均強度；也可以算熒光的累積而不算平均。

要根據課題需要選擇合適的測量統計方法。

● 熒光照片效果不好？

熒光拍照存在很多變量，每一個變量都會嚴重影響拍照效果。

熒光拍攝條件：拍攝環境、顯微鏡品牌和激發熒光決定了鏡下觀察的效果。同樣的操作方法和切片，在不同品牌顯微鏡下顯示出完全不同的熒光強度。

熒光衰減：熒光物質的衰減通常都是非常明顯的。同樣的一組切片，1小時內拍攝和8小時后拍攝，熒光效果完全不同。

最好用激光共聚焦顯微鏡，激光共聚焦顯微鏡的分辨率比普通熒光顯微鏡要高的多，通常同一張片子激光共聚焦的效果明顯更優。