SNP基因分型PCR試劑（探針法由北京百奧萊博供貨并提供相關技術服務支持，本品用于生化實驗研究等領域，本品質量穩定，價位合理，需要SNP基因分型PCR試劑（探針法等核酸擴增(PCR)產品的客戶，請到我公司官網聯系我們。...

特別提示：包括SNP基因分型PCR試劑（探針法)在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：SNP基因分型PCR試劑（探針法)
英文名稱：BaiExact Genotyping qPCR PreMix（Probe)
產品貨號：WH0109
產品規格：125次|500次

本制品是一款專門應用于探針法SNP檢測的即用型2×濃度的熱啟動PCR預混試劑。該預混試劑含有特異的抗體修飾Taq DNA聚合酶，能有效檢測低豐度的DNA模板。精心配制的獨特PCR緩沖液能有效消除眾多PCR抑制劑對PCR的抑制及對熒光信號淬滅的影響，對SNP鑒定有很好的特異性和擴增效率。

產品特點：
1．防彈式基因分型---輕松屏蔽PCR抑制劑對SNP分型的影響。
2．快速反應----對多數實驗能夠執行快速PCR操作。
3．熒光信號強----強勁的SNP分型僅需少量的引物探針。
4．避免操作失誤----添加藍色指示染料，監控實驗添加過程。

試劑盒原理：
本制品適用于水解探針法進行模板的熒光定量PCR和SNP檢測，該產品可以克服PCR反應液中的抑制因子，特別是對粗提樣本，其表現出高度的抗逆性。適用于植物，動物，以及一些環境樣本的粗提液。

2×BaiExact Genotyping PreMix（Probe)中特異的抗體修飾熱啟動Taq DNA聚合酶，95℃條件下僅需2~5分鐘即可激活全部酶活，減少了反應時間，同時大限度的減少PCR擴增全程中的非特異性擴增，配合精心優化的buffer體系，使該產品對于序列變異的鑒定有很好的特異性和擴增效率。

2×BaiExact Genotyping PreMix（Probe)包含dNTPs，增強劑，穩定劑等以提高產物特異性和反應靈敏度，并包含一種微藍色的指示染料，該染料對PCR反應以及探針熒光沒有任何影響；使操作更加方便，避免大量樣本小體系（10μl體系）操作過程中容易產生的加樣錯誤。

試劑盒組成：

組分	20μl×125次	20μl×500次
2× BaiExact Genotyping PreMix（Probe)	1.25ml	4×1.25ml
50×ROX Reference Dye	250 μl	1ml
RNase-Free ddH2O	2×1ml	5×1ml

儲存條件：收到本產品后，請立即置于-20℃避光保存，在該條件下避光可保存2年。從-20℃取出使用時，將凍存的2× BaiExact Genotyping qPCR PreMix（Probe)和50×ROX Reference Dye溶解，然后輕輕顛倒混勻，待溶液完全均一后再行使用。如解凍后沒有使用，須徹底混勻后重新冷凍（在解凍過程中鹽會出現分層現象，未混勻進行冷凍，鹽晶體的析出將會對酶造成損害)。如需一段時間內經常取用，可在2～8℃條件下儲存3個月。避免反復多次凍融。

注意事項：請務必在使用本試劑盒之前閱讀此注意事項。
1．如果試劑沒有混勻，其反應性能會有所下降。使用時請上下顛倒輕輕混勻，請不要使用振蕩器進行混勻，盡量避免出現泡沫，并經瞬時離心后使用。
2．本產品中不含有熒光探針。
3．引物終濃度為300 nM，探針終濃度為200 nM可以在大多數體系中獲得良好的擴增結果。需要進一步優化引物濃度的，可以在100-900 nM范圍內調整；需要進一步優化探針濃度的，可以在100-250 nM范圍內調整。
4．20 μl反應體系中，基因組DNA模板的使用量一般小于100ng。

操作步驟：

一、建立Real-Time PCR反應體系：
1．溶解2× BaiExact Genotyping PreMix （如果保存在-20℃)，50×ROX Reference Dye，模板，引物、探針和RNase-Free ddH2O，并將所有試劑在室溫下平衡并徹底混勻。
2.建議置于冰上進行Real-Time PCR反應液的配制。反應體系如下：

成分	使用量（20μl體系)	終濃度
2× BaiExact Genotyping PreMix（Probe)	10μl	1×
正向引物（10μM）①	0.6μl	0.1～0.9μM
反向引物（10μM）①	0.6μl	0.1～0.9μM
探針（10μM）②	0.4μl	0.1～0.25μM
模板	2μl	-
50×ROX Reference Dye③	-	-
RNase-Free ddH2O	至20μl	-

①引物終濃度為0.3 μM可以在大多數體系中獲得良好的擴增結果。擴增效率不高時，可增加PCR反應體系中的引物濃度；發生非特異擴增時，可適當減少PCR反應體系中的引物濃度。需要進一步優化引物濃度的，可以在0.1-0.9 μM范圍內調整。
②探針的濃度與使用的Real-Time PCR擴增儀、探針種類、熒光標記物質種類有關，實際使用時請參照儀器說明書，或各熒光探針的具體使用說明進行。通常探針終濃度為0.2 μM可以在大多數體系中獲得良好的擴增結果。需要進一步優化探針濃度的，可以在0.1-0.25 μM范圍內調整。
③幾種常見儀器的zuì適ROX Reference Dye濃度如下：
  ABI PRISM 7000/7300/7700/7900HT/Step One等：5×（例如：5μl ROX/50μl體系)；
  ABI 7500、7500 Fast；Stratagene Mx3000P、Mx3005P和Mx4000等：1×（例如：1μl ROX/50μl體系)；
  Roche儀器，Bio-Rad儀器，Eppendorf儀器等：無需添加。
3.蓋上反應管，輕柔混勻。可短暫離心，確保所有組分均在管底。
4.將反應體系置于熒光定量PCR儀中，開始反應。

二、進行Real time PCR反應：
建議采用兩步法PCR反應程序進行反應；若模板量較低等因素導致擴增效果不佳，可使用三步法程序進行PCR反應。

兩步法反應程序：

階段	循環	溫度	時間	內容	熒光信號采集
預變性	1×	95℃	2min④	預變性	否
PCR反應	40×	95℃	15sec	變性	否
		60℃	30sec⑤	退火/延伸	是

三步法反應程序：

階段	循環	溫度	時間	內容	熒光信號采集
預變性	1×	95℃	5min④	預變性	否
PCR反應	40×	95℃	15sec	變性	否
		50-60℃	15sec	退火	否
		72℃	30sec⑤	延伸	是

④解鏈時間的長短與模板的長度和GC含量有關。
⑤使用不同型號儀器進行時間設定時，請按照儀器使用說明書要求進行實驗操作，幾種常見儀器的時間設定見下表：
  使用Roche，ABI 7500 Fast，BioRad和Agilent等公司熒光定量PCR儀時請設定在15sec。
  使用ABI 7900HT/7900HT Fast/ViiA 7/StepOne/StepOnePlus時請設定在20 sec。
  使用ABI 7000和7300時請設定在31 sec。
  使用ABI7500時請設定在32 sec。

常見問題：

1．低濃度模板時擴增曲線混亂，熒光強度變弱

原因	解決辦法
目標DNA的拷貝數過少	反應液中的目標DNA拷貝數只有幾倍到幾十倍時，拷貝數散亂的概率變大，容易形成線性混亂。請適當提高樣品濃度再進行反應。
與引物二聚體發生競爭	目的片段擴增的同時出現引物二聚體的擴增，由于競爭使目的片段的擴增反應變弱。請摸索反應條件或重新設計引物，以防止引物二聚體的形成。
DNA被反應離心管吸附而損失	模板濃度較低或樣品稀釋后長時間存放時，會導致DNA被反應離心管吸附而損失。請提高樣品濃度再進行反應。如果對樣品進行稀釋，建議稀釋后立即進行反應。

2．重現性差

原因	解決辦法
儀器方面的故障	因為儀器的不適用，在溫度管理或檢測時產生重現性差。請根據相應儀器的說明書進行點檢。
樣品純度不好	不純的樣品會導致實驗的重現性差。
稀釋的模板放置太久	濃度較低的DNA溶液存放時間較長時，由于被管壁吸附從而實際濃度會更低，建議從原液重新稀釋后再進行反應。另外，通過梯度稀釋的標準樣品zuì好每次使用時直接從原液稀釋。
引物或探針質量下降	盡量避免新合成引物批次間的差異，可以使用原來質量好的引物做為對照。
PCR反應條件、引物濃度、序列等不恰當	擴增效率差的PCR較容易產生重現性差。通過變更引物和探針的濃度或PCR反應條件來進行調整。擴增不好時，一般可降低退火溫度或提高引物濃度，也可以延長延伸時間。如模板的GC含量較高，可延長變性時間。仍得不到改善時，建議重新設計引物和探針。
計量誤差	反應體積太小會導致檢測精度下降。請根據定量PCR儀推薦的反應體積重新實驗。

3．NTC可見擴增

原因	解決辦法
發生交叉污染	請更換新的試劑或滅菌水。仍無法得到改善時，請嘗試到新的實驗環境進行操作。
儀器設定誤差（多重PCR）	當使用幾種熒光探針時，請正確設定熒光測定，防止出現因不同染料的光譜交叉而導致的檢測信號差異。

4．擴增曲線熒光信號很弱，或擴增曲線呈鋸齒狀

原因	解決辦法
檢測光光譜設定誤差	由于目前不同熒光定量PCR儀的原理和提供的檢測光光譜范圍的差異，因此在選擇探針的發光基團和淬滅基團時一定要根據所用的儀器型號設置的可檢測的熒光信號范圍內選擇。請參照儀器的使用說明書，重新確定參數設置。
熒光探針純度太低	請使用HPLC級別以上純化的Probe，否則殘留的未結合的熒光染料會造成基線上飄，從而導致擴增產物所產生的熒光值變低。
熒光探針質量較差	由于探針保存中分解導致基線上飄，從而導致擴增產物所產生的熒光值變低。此外，一部分熒光染料不適合含有EDTA的buffer進行保存。請按照Probe合成公司推薦的保存條件。
熒光采集時間太短	對部分儀器，需要更長的延伸時間來充分采集熒光。擴增曲線鋸齒狀較明顯時，將延伸時間設定為45-60 sec可得到改善。

根據您的關注的SNP基因分型PCR試劑（探針法)，SNP基因分型試劑盒，您可能還對以下產品有需求：



名稱：2×BAmp MasterMix(含染料)
貨號：WE0106
規格：5ml
  BAmp MasterMix由BAmp DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTPs以及PCR穩定劑和增強劑組成的預混體系，濃度為2×。BAmp DNA Polymerase是一種兼具高擴增效率和高保真性的耐熱聚合酶。其主要特點是可以擴增長片段DNA，尤其在擴增>10 kb的DNA片段方面，其更加明顯，所擴增的片段zuì長可以達到40 kb。該酶具有高度的延伸和校對能力，保真度高于普通Taq酶。預配好的PCR混合液使操作更加簡單快捷，可zuì大限度地減少人為誤差和污染。的MasterMix配方使整個反應體系非常穩定，重復性好。本產品已加入染料(藍色)，反應結束后可直接進行電泳檢測，無需再使用上樣緩沖液。擴增得到的PCR產物3"端附有一個“A”堿基，因此可直接用于T/A克隆。適用于構建基因圖譜、序列測定及分子遺傳學研究等。

產品組成：

組份	1ml	5ml
2×BAmp MasterMix(With Dye)	1ml	5×1ml
ddH2O	1ml	5×1ml

注意：2×BAmp MasterMix含有BAmp DNA Polymerase,3 mM MgCl2 和400μM each dNTP。

質量控制：
1、經檢驗無外源核酸酶活性；
2、PCR方法檢測無宿主殘余DNA；
3、能有效地擴增多種基因組中的單拷貝基因。

使用方法：
以下舉例為以人基因組DNA為模板，擴增1 kb的片段的PCR反應體系和反應條件，實際操作中應根據模板、引物結構和目的片段大小不同進行相應的改進和優化。

1、PCR反應體系

試劑	50μl反應體系	終濃度
2×BAmp MasterMix(With Dye)	25μl	1×
Forward Primer，10μM	2μl	0.4μM
Reverse Primer，10μM	2μl	0.4μM
Template DNA	<0.5μg	<0.5μg/50μl
ddH2O	up to 50μl

注意：引物濃度請以終濃度0.1-1.0μM作為設定范圍的參考。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發生非特異性反應時，可降低引物濃度，由此優化反應體系。

2、PCR反應條件

步驟	溫度	時間	循環數
預變性	94℃	2 min
變性	94℃	30 s	25-35 個循環
退火	55-65℃	30 s
延伸	72℃	30 s
終延伸	72℃	5 min

注意：
1)一般實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm低5℃，無法得到理想的擴增效率時，適當降低退火溫度；發生非特異性反應時，提高退火溫度，由此優化反應條件。
2)延伸時間應根據所擴增片段大小設定，BAmp DNA Polymerase的擴增效率為2.0 kb/min。
3)可根據擴增產物的下游應用設定循環數。如果循環次數太少，擴增量不足；如果循環次數太多，錯配機率會增加，非特異性背景嚴重。所以在保證產物得率的前提下應盡量減少循環次數。

儲存條件：-20℃，避免反復凍融。

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貨號	名稱	規格
BTN60804	PCR抑制物清除劑	1mL
BTN70902	5M甜菜堿溶液，PCR級	1.5mL
BTN130923	LAMP擴增陽性對照	50次
YT376	PCR Buffer套裝(用于PCR優化)	5ml
ALH286	10mM dNTP混合溶液	1ml|5ml
ALH257	M-MuLV反轉錄酶(不含RNase H活性)	10KU|10KU×5

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