T3體外轉錄試劑盒由北京百奧萊博供貨并提供相關技術服務支持，本品用于科研試驗，我公司專注于核酸擴增(PCR)產品的研發、生產和供應，為您提供的T3體外轉錄試劑盒質量可靠，批間差小，且價格公道，熱切盼望您選購我們的產品。...

特別提示：包括T3體外轉錄試劑盒在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：T3體外轉錄試劑盒
英文名稱：T3 in vitro Transcription Kit
產品貨號：BTN91108
產品規格：50次

本試劑盒是基于沙門氏噬菌體T3 RNA聚合酶的RNA體外轉錄試劑盒，它利用含有T3啟動子的模版DNA，以NTP為底物，從T3啟動子下游開始合成與模板DNA中一條鏈互補的RNA，簡單快速獲得大量的RNA分子。

產品特點：
1. 即開即用，用戶只需提供含T3啟動子的DNA模板即可以進行體外轉錄實驗，不需耍單獨準備每一個成份。
2. 單溶液預配液，減少加樣次數，避免了操作誤差，增加了可重復性。
3. 模板DNA可以是線性化的質粒DNA，也可以是PCR擴增產物。
4.可以合成的RNA的zuì佳長度在20nt到5000nt之問。
5.產品配方經過精心優化，每μg DNA模板可以合成2-6μg RNA。
6. 得到的RNA可以用于RNA結構研究、核解生物化學、體外翻譯、RNA-蛋白質相互作用、反義技術、SELEX技術和RNA干擾(RNAi)等實驗。

試劑盒組成：

成分	規格
轉錄預配液(2×)	0.5mL
陽性對照DNA(1.3 Kb片段)	20μL(10ng/μL)
T3 RNA聚合酶混合液	50μL
RNase-free水	1mL
說明書	1份

儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、制備DNA模板
PCR片段和質粒DNA都可以用作體外轉錄的模板，但是必須注意以下幾點：
1)必須使用線性化的DNA。如果是質粒DNA，則必須先用適當的限制性內切酶切成線狀。
2)是需要轉錄的DNA序列的上游必須有T3啟動子。如果模板是PCR產物，則可以在設計引物時將T3啟動子序列(5′AATTAACCCTCACTAAAGG 3′)加上。如果是將DNA片段克隆到載體上，則需要選擇有T3啟動子的載體，并且克隆位點必須位于T3啟動子下游。
3)是需要轉錄的DNA序列的下游端zuì好不要是3′突出。如果是3′突出(如選擇了Pst I來線性化質粒)，則zuì好用T4 DNA聚合酶修平。
4)是必須保證DNA模板中沒有RNase。由于提取質粒DNA的過程中一般要使用大量的RNase A，因此質粒DNA一般都有嚴重的RNase A污染，所以在用作模板前，zuì好采取膠回收得方法回收質粒DNA。并且加入少量總RNA一起保溫，然后電泳檢測RNA是否被降解，以此判斷純化的DNA模板是否有殘留RNase A。

二、體外轉錄反應
1.在一個RNase-free的塑料離心管中，在室溫下(不是在4℃下)按次序加入下列成分：

成分	加入量	備注
DNA模板	xμl	總量在50 ng-1μg(如果模板是PCR片段，建議用50ng左右；如果模板是質粒DNA，建議用1μg左右；如果用本產品提供的陽性對照，建議用4μL)
轉錄預配液，2×	10μl	需室溫時使用
T3 RNA聚合酶混合液	1μl	本成分還含其他促進劑，所以是混合物
RNase-free水	補水到20μL

注：此為20μL反應體系的用量，對其他體積的反應體系，各成分的用量可以按比例增減。如果需要標記RNA探針，則需要定做NTP分開而不是NTP預先混合的試劑盒。如果需要得到加帽RNA，則需要加入自備的加帽修飾核苷酸(本公司有各種加帽修飾核苷酸)。
2. 37℃保溫1-2小時。注意：延長保溫時間并不能提高產量。
3. 70℃加熱10分鐘滅活T3 RNA聚合酶。
4. 取1-3μL電泳檢測轉錄效果。一般1μg DNA可以合成 5-10μg的RNA。
5. 得到的RNA可以放-80℃保存。

若需進一步去除DNA模板，可參考下列操作步驟，但所用試劑需另行購買，本試劑盒不提供。
1.在體外轉錄結束后，在反應體系中加入3-5U自備的RNase-free DNase(BTN90903；3-5U/μL)。
2. 37℃保溫15-30分鐘。
3. 補水到100μL，
4. 用自備的等體積(100μL)的Tris飽和酚-lǜ仿抽提一次去除殘留的DNase和RNA聚合酶。
5.在上清中加200μL自備的微量核酸沉淀劑(BTN50903；用前需要搖晃混勻)，振蕩后15000rpm離心3～5分鐘，棄上清。
6. 加入1mL 75%乙醇，震蕩10秒后15000rpm離心3～5分鐘，棄上清。
7. 短暫離心數秒，用槍頭吸棄上清。
8. 晾干半分鐘，所得沉淀即去除DNA模板后的RNA?？扇苡赗Nase-free水中后立即使用或放-80℃長期保存。

疑難解答：
1、沒有RNA產物。zuì常見原因是DNA模板有RNase污染，測試方法是用純化的RNA跟模板DNA一起保溫，再檢測RNA是否降解。本試劑盒緩沖液和酶混合液中有RNase inhibitor，如果模板RNase污染嚴重，可能需要用戶補加RNase inhibitor。
2、RNA產量低。zuì常見的原因是DNA模板序列。在轉錄序列的個和第二個堿基zuì好都是G，在前14個堿基內避免有U存在。
3、RNA長度比預期的短?？赡苁悄０逍蛄兄杏蠺3 RNA聚合酶的終止序列?？梢愿挠肧P6或T7體外轉錄試劑盒(啟動子也必須改成SP6或T7啟動子)。
4、RNA長度比預計的長。T3 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一樣，有不依賴于模板的加尾功能，zuì多有一半的RNA可以帶一個或兩個堿基的尾巴。如果RNA長度比預計的長很多，使用的模板又是質粒DNA，則可能是質粒DNA線性化不徹底。
5、5′單磷酸還是三磷酸。如果使用GTP，則得到的RNA是三磷酸，體外轉錄時如果保溫時間太長(如12小時)，則有50%的三磷酸會變成單磷酸。如果在轉錄體系中加入GMP，則T3 RNA聚合酶將優先使用GMP，所得RNA產物中5′端是單磷酸的比例將大大增加。

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名稱：25mM氯化鎂溶液(PCR級MgCl2溶液)
貨號：BTN90302
規格：5mL
本產品為專門用于PCR的MgCl2，其濃度為25mM，可以用于調節MgCl2的zuì佳濃度。

儲存條件：低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。

名稱：miRNA熒光定量RT-PCR檢測試劑盒
貨號：BTN131042
規格：25次
本試劑盒采用SYBR Green I 嵌合熒光染料法的原理來進行miRNA熒光定量PCR檢測。本產品是專門為miRNA定量檢測而研發的新一代預混形式的熒光定量PCR檢測試劑。2×miRNA qPCR Mix包含有Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應緩沖液、PCR增強劑等所有PCR所需要的成分。miRNA qPCR Mix中所含的熒光染料SYBR Green I可以與所有的雙鏈DNA結合，使該產品可用于不同靶序列的檢測而不需合成特異性標記探針。其中的Taq DNA polymerase是經化學修飾的熱啟動酶，配合獨特的緩沖體系，使反應特異性更好，靈敏度更高，并能在更廣的范圍內對miRNA進行準確定量。

產品特點：
1. 簡便、快捷完成miRNA的檢測。
2. 檢測通量高，只需zuì少的RNA樣本，即可同時進行多種目標miRNA的檢測。
3. 檢測特異性好，獨特的miRNA引物設計技術及其優化的反應體系避免了非特異性擴增、特別是Pre-miRNA的污染。
4. 檢測分辨率高：該系統能分辨單堿基差異的miRNA。
5. 檢測靈敏度高：可在低至pg級的總RNA中檢測到特異表達的miRNA。

試劑盒組成：

成分	規格
2×miRNA qPCR Mix	0.75ml
Reverse Primer(10μm)	30μl
RNase-Free Water	1ml
miRNA cDNA鏈合成試劑盒	25T
說明書	1份

儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、miRNA cDNA鏈合成
請參見miRNA cDNA 鏈合成試劑盒產品使用說明書。

二、miRNA熒光定量檢測
1.室溫融化2×miRNA qPCR Mix和Reverse primer(10μm)。
2. 使用時請將2×miRNA qPCR Mix上下顛倒輕輕均勻混合，避免起泡，并經短暫離心后使用。如果試劑沒有混勻，其反應性能會有所下降。
3. 按照下表組分配制熒光定量PCR反應體系：

試劑組份	體積
2×miRNA qPCR Mix	25μl
Forward Primer(自備)	1μl
Reverse Primer	1μl
miRNA 鏈cDNA	xμl
RNase-Free Water	至50μl

4. 建議反應程序設置如下：

循環	溫度	時間
1×	95℃	10min
40～45×	95℃	15s
	60℃	1min
溶解曲線分析	根據PCR儀要求設定

注意事項：
1. miRNA 鏈cDNA的加入量不要超過Real time PCR 體積10%。
2. 對于特殊的檢測體系，高含量的cDNA 模板易導致非特異性擴增，根據所檢測miRNA的豐度適當的稀釋cDNA(稀釋10倍或者100倍)。
3. 2×miRNA qPCR Mix中含有SYBR Green I和ROX染料，保存本產品或配制PCR反應液時應避免強光照射。

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