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特別提示：包括蛋白電泳預制膠(12%，10孔/15孔)在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：蛋白電泳預制膠(12%，10孔/15孔)
英文名稱：Protein electrophoresis precast gels
產品貨號：SNM457
產品規格：10塊/盒



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本Western轉膜液是一種安全的轉膜液，沒有使用劇毒的甲醇，也沒有使用其它的有毒試劑。本Western轉膜液配制便捷，無需調節pH值，用于Western時濕法電轉膜。本Western轉膜液可以回收，回收后可以再使用2-3次。

使用方法：
1、取一袋可以配制1升Western轉膜液的粉劑，倒入到一潔凈的燒杯中，加入蒸餾水到約700毫升，溶解。
2、再加入200毫升無水乙醇或210毫升95%乙醇，混勻。
3、然后在量筒中用蒸餾水定容到1升。混勻后即可使用。沒有用完的轉膜液可室溫保存，通常兩周內使用沒有任何問題。當轉膜液顏色變為淺棕色或黃褐色時，應該丟棄。

儲存條件：室溫，有效期2年。

名稱：2%封閉試劑
貨號：KFS071
規格：500ml

名稱：His標簽蛋白瓊脂糖純化樹脂
貨號：SY0392
規格：10ml|50ml|100ml
Ni-NTA Agarose Resin以高度交聯的4%瓊脂糖凝膠為基質，通過化學方法偶聯四配位的氮川三乙酸（NTA）為配體，螯合鎳離子（Ni2+）后，形成非常穩定的八面體結構，鎳離子處于八面體的中心，這樣的結構可保護鎳離子免受小分子的進攻，與Ni-IDA樹脂相比，更加穩定，可以耐受一定濃度的還原劑、變性劑或耦合劑等苛刻條件。已經成為實驗室純化His標簽蛋白不可獲取的樹脂之一。

基質（Matrix）：高度交聯的4%瓊脂糖凝膠
孔徑（Bead size）：45-165μm
載量（Capacity）：＞40mg 6×His-tagged protein/ml 基質
耐壓（Tolerance Pressuremax）：0.1MPa, 1bar
儲存緩沖液：含20%乙醇的1×PBS
儲存條件：4℃，有效期2年。


使用方法

（一）純化流程

1 緩沖液的準備
緩沖液使用原理：低咪唑上樣，高咪唑洗脫，或者高pH上樣，低pH洗脫。Buffer 在使用前zuì好用0.22μm或0.45μm濾膜過濾除菌。可溶性組氨酸標簽蛋白純化所需配方詳見附表1。包涵體組氨酸標簽蛋白純化所需緩沖液及配方詳見附表2。

2 樣品準備
2.1 細菌表達的蛋白（本說明以細菌表達的蛋白純化為例）
1）挑取單菌落到含有適合抗性的LB培養基中，根據載體說明加入相應的誘導劑誘導相應的時間。
2）表達結束后，將培養液轉至離心瓶，7000rpm，離心15min，收集菌體，然后加入1/10體積的裂解液（Lysis buffer）和PMSF（PMSF在破碎前加入，其終濃度為1mM），同時也可加入其他蛋白酶抑制劑，但不能影響目的蛋白與樹脂的結合。
3）之后加入溶菌酶，使其工作濃度為1mg/ml?！咀ⅰ浚喝绻磉_的宿主細胞內含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。
4）將菌體沉淀懸浮起來（如果菌液濃度高，可考慮加入10μg/ml RNase A和5μg/ml DNase I），混勻，置于冰上超聲破碎細胞，至菌液基本保持澄清。
5）收集上述澄清蛋白液，10000rpm，4℃離心20-30min。取上清0.22μm或0.45μm濾膜過濾后置于冰上備用或-20℃保存。
2.2 酵母、昆蟲和哺乳細胞分泌表達的可溶性蛋白
將細胞培養液轉移至離心瓶，5000rpm離心10min，收集上清。如上清中不含EDTA、組氨酸和還原劑等，即可直接上柱純化；如含有EDTA、組氨酸和還原劑等物質，則需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。
【注】：對于大量體積的上清，需加入硫酸銨進行沉淀濃縮，之后經1×PBS 4℃下透析后上柱。
2.3 包涵體蛋白純化（以細菌為例）
1）將培養液轉移至離心瓶，7000rpm，離心15min，收集菌體去上清。
2）按照菌體：裂解液=1:10（w/v）的比例將菌體充分懸浮，混勻，冰浴超聲破碎。
3）將破碎液轉移至離心管，10000rpm，4℃離心20-30min，去上清。可重復步驟2）和3）一次。
4）按照菌體：裂解液（含8M尿素）=1:10（w/v）的比例將包涵體充分懸浮。
5）變性條件下純化His標簽蛋白純化。

3樣品純化

1）裝柱：將Ni-NTA Agarose Resin借助重力的作用裝入合適的純化柱中。
2）清洗：3-5倍柱體積去離子水沖洗色譜柱。
3）平衡：至少5倍柱體積的Lysis Buffer 平衡色譜柱。
4）上樣：注意控制加樣速度，確保目的蛋白與Ni2+充分接觸，以提高純化得率。
【注】：注意收集流出液，用于后續SDS-PAGE檢測蛋白的結合情況。
5）平衡/洗雜：Wash Buffer 平衡柱子，直到紫外吸收達到一個穩定的基線（一般至少10-15個柱體積）。注意收集流出液。
【注】：在樣品和結合緩沖液中加入低濃度咪唑可以提高樣品純度。
6）洗脫：使用5-10倍柱體積Elution Buffer洗脫，收集洗脫液即目的蛋白溶液。
7）清洗：依次用3倍柱體積的Lysis Buffer和5倍柱體積的去離子水清洗樹脂。
【注】：建議在清洗之前用更高濃度咪唑（如500mM）徹底清洗純化柱上結合的雜蛋白。
8）保存：5倍柱體積的20%乙醇平衡樹脂，zuì后將樹脂保存在20%乙醇的1×PBS中，置于4℃保存。

4 SDS-PAGE檢測
將純化過程中得到的樣品（包括原始樣品、流出組分、洗雜及洗脫組分等）利用SDS-PAGE進行檢測，判定其純化效果。

（二）在位清洗
當填料使用過程中發現反壓過高（＞0.5Mpa）或者填料上面出現明顯的污染時，需對其進行在位清洗（Cleaning-in-Place，CIP）。在位清洗時，先把Ni2+脫掉，清洗結束后，將填料保存在20%乙醇中，后者重新掛Ni后再保存在20%乙醇中。建議按照下面操作去除填料上殘留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

1 去除強疏水結合的蛋白，脂蛋白和脂類
使用30%異丙醇清洗5-10個柱體積，接觸時間為15-20min可以去除此類污染物。之后再用去離子水清洗10倍柱體積。也可以選擇使用含有去污劑的酸性或者堿性溶液清洗填料2倍柱體積。例如含有0.1-0.5%非離子去污劑的0.1M醋酸溶液，接觸時間為1-2h。去污劑處理后，需用70%的乙醇清洗5倍柱體積，徹底去除去污劑。zuì后利用去離子水清洗10倍柱體積。

2 去除離子作用結合的蛋白
使用1.5M NaCl 溶液接觸10-15min，之后用去離子水清洗10倍柱體積。

（三）填料再生

當填料使用過程中發現反壓過高，填料上面出現明顯的污染，或填料載量明顯變低時，需要對其進行鎳離子剝離及重新掛鎳處理，即填料再生。按照下面操作流程進行：

1）使用0.2M 醋酸溶液（含6M GuHCl）清洗2倍柱體積；
2）去離子水清洗5倍柱體積；
3）2%SDS清洗3倍柱體積；
4）去離子水清洗5倍柱體積；
5）乙醇清洗5倍柱體積；
6）去離子水清洗5倍柱體積；
7）100mM EDTA（pH 8.0）清洗5倍柱體積；
8）去離子水清洗5倍柱體積；
9）100mM NiSO4清洗5倍柱體積；
10）去離子水清洗10倍柱體積。

填料再生后，可立即使用，也可保存在20%乙醇中，置于4℃備用。


附表1 可溶性His標簽蛋白純化所需緩沖液及配方

緩沖液名稱	配方	配制1L溶液所需各種試劑量
Lysis Buffer (pH8.0)	50mM NaH2PO4 300mM NaCl 10 mM imidazole NaOH調pH至8.0, 0.22μm或0.45μm過濾除菌	NaH2PO4 ·2H2O    7.8g NaCl             17.54g Imidazole         0.68g
Wash Buffer (pH8.0)	50mM NaH2PO4 300mM NaCl 20 mM imidazole NaOH調pH至8.0, 0.22μm或0.45μm過濾除菌	NaH2PO4 ·2H2O    7.8g NaCl             17.54g Imidazole         1.36g
Elution Buffer(pH8.0)	50mM NaH2PO4 300mM NaCl 250 mM imidazole NaOH調pH至8.0, 0.22μm或0.45μm過濾除菌	NaH2PO4 ·2H2O    7.8g NaCl             17.54g Imidazole         17.0g

附表2 包涵體His標簽蛋白純化所需緩沖液及配方

緩沖液名稱	配方	配制1L溶液所需各種試劑量
Lysis Buffer (pH8.0)	8M Urea 100mM NaH2PO4 100 mM Tris·HCl 鹽酸溶液調pH至8.0, 0.22μm或0.45μm過濾除菌	Urea             480.5g NaH2PO4 ·2H2O    15.6g Tris              15.76g
Wash Buffer (pH6.3)	8M Urea 100mM NaH2PO4 100 mM Tris·HCl 鹽酸溶液調pH至6.3, 0.22μm或0.45μm過濾除菌	Urea             480.5g NaH2PO4 ·2H2O  15.6g Tris              15.76g
Elution Buffer(pH4.50)	8M Urea 100mM NaH2PO4 100 mM Tris·HCl 鹽酸溶液調pH至4.5, 0.22μm或0.45μm過濾除菌	Urea             480.5g NaH2PO4 ·2H2O    15.6g Tris             15.76g

附表3 Ni-NTA Agarose Resin試劑耐受情況

試劑種類	濃度
還原劑	5mM DTE 0.5-1 mM DTT 20mM β-mercaptoethanol 5mM TCEP 10mM reduced glutathione
變性劑	8M urea 6M Gua-HCl
去污劑	2% TritonTM X-100(nonionic) 2% TweenTM20(nonionic) 2% NP-40(nonionic) 2% Cholate (anionic) 1% CHAPS (zwitterionic)
其他類	500mM imidazole 20% ethanol 50% glycerol 100mM Na2SO4 1.5M NaCl 1mM EDTA 60mM citrate
緩沖液	50mM sodium phosphate, pH7.4 100mM Tris-HCl, pH7.4 100mM Tris-acetate, pH7.4 100mM HEPES, pH7.4 100mM MOPS, pH7.4 100mM sodium acetate, pH7.4

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