北京百奧萊博供應(yīng)的動(dòng)物組織/細(xì)胞線(xiàn)粒體提取試劑盒用于科研試驗(yàn)，我公司的動(dòng)物組織/細(xì)胞線(xiàn)粒體提取試劑盒品質(zhì)上佳，經(jīng)過(guò)多年的開(kāi)發(fā)生產(chǎn)，已然非常成熟，歡迎廣大新老客戶(hù)訂購(gòu)。...

特別提示：包括動(dòng)物組織/細(xì)胞線(xiàn)粒體提取試劑盒在內(nèi)，本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

產(chǎn)品名稱(chēng)：動(dòng)物組織/細(xì)胞線(xiàn)粒體提取試劑盒
英文名稱(chēng)：Animal tissue/cell Mitochondrion Extraction Kit
產(chǎn)品貨號(hào)：XH009
產(chǎn)品規(guī)格：50T|100T

本試劑盒用于從動(dòng)物細(xì)胞或組織中分離出完整而純化的線(xiàn)粒體。適合于動(dòng)物軟組織（肝或腦組織）和硬組織（肌肉）以及培養(yǎng)細(xì)胞的線(xiàn)粒體的制備。其制備物產(chǎn)量高，可以被用于細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、代謝和蛋白組學(xué)等的研究。

試劑盒組成：

組份	50T	100T
Lysis Buffer	50mL	100 mL
Mito-Wash Buffer	25 mL	50mL
Store Buffer	5 mL	10 mL

保存條件：4℃可保存一個(gè)月，長(zhǎng)期請(qǐng)置于-20℃保存。

操作步驟：
1．樣本處理
a．組織勻漿：稱(chēng)取100~200mg新鮮組織如肝臟、腦、心肌等，PBS或生理鹽水沖洗，洗凈血水，濾紙吸干，用剪刀剪為碎塊放入小容量玻璃勻漿器內(nèi)。加入1.0 mL冰預(yù)冷的Lysis Buffer，0℃冰浴上下研磨組織20次；
b．培養(yǎng)細(xì)胞勻漿：消化細(xì)胞，PBS洗滌，800×g 5~10min離心收集細(xì)胞。計(jì)數(shù)。每次提取需要5×10⁷個(gè)細(xì)胞，加入1.0 mL冰預(yù)冷的Lysis Buffer重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到小容量玻璃勻漿器內(nèi)，0℃冰浴研磨30~40次；
2．將組織或細(xì)胞勻漿物轉(zhuǎn)移到離心管，4℃，1000×g離心5min；
3．取上清，加入一新的離心管中，4℃，1000×g再次離心5min。
4．取上清，加入一新的離心管中，4℃，12,000×g離心10min。離心后的上清含胞漿成分，可從中提取胞漿蛋白。將上清轉(zhuǎn)移到新離心管，線(xiàn)粒體沉淀在管底；
5．在線(xiàn)粒體沉淀中加入0.5 mL Wash Buffer重懸線(xiàn)粒體沉淀，4℃，1000×g離心5min；
6．取上清，加入一新的離心管中，4℃，12,000×g離心10min。棄上清，高純度的線(xiàn)粒體沉淀在管底；
7．用50～100μL Store Buffer或合適的反應(yīng)緩沖液重懸線(xiàn)粒體沉淀，立即使用或-70℃保存。

注意事項(xiàng)：
1．為保證獲得完整的線(xiàn)粒體，是全程低溫操作。第二是快速。第三，在不破壞亞細(xì)胞器的情況下破碎細(xì)胞是制備線(xiàn)粒體的zuì關(guān)鍵環(huán)節(jié)。與組織塊相比，培養(yǎng)細(xì)胞特別是貼壁培養(yǎng)細(xì)胞在用玻璃勻漿器勻漿時(shí)較難破壁，因而要選用小容量玻璃勻漿器、間隙嚴(yán)密的研杵上下研磨培養(yǎng)細(xì)胞。
2．以離心力g計(jì)算正確的離心速度，不同的離心機(jī)可據(jù)此計(jì)算離心速度。
3．進(jìn)行Western Blot和2D-膠電泳，可直接加入上樣緩沖液裂解線(xiàn)粒體。

一般低溫度心機(jī)都有離心力顯示，如果沒(méi)有，可以用以下公式簡(jiǎn)單的換算。
  G＝1.11×(10^-5)×R×[rpm]²
G為離心力，一般以ｇ（重力加速度）的倍數(shù)來(lái)表示；[rpm]²即：轉(zhuǎn)速的平方；R為半徑，單位為厘米。

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名稱(chēng)：Percoll
貨號(hào)：BTN131134
規(guī)格：250mL
Percoll是一種常用的低粘度的密度梯度介質(zhì)，由直徑在15-30nm的硅膠顆粒組成，顆粒外包被了聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，為化學(xué)惰性，不會(huì)影響細(xì)胞的活性。

產(chǎn)品特點(diǎn)：
1．Percoll滲透壓很低(<20mosm/kg H2O)，粘度也很小，可形成高達(dá)1.3g／ml 密度。
2．采用預(yù)先形成的密度梯度時(shí)可在低離心力(200～1000g)于數(shù)分至數(shù)十分鐘內(nèi)達(dá)到滿(mǎn)意的細(xì)胞分離結(jié)果。
3．離心后能形成1-1.3g/mL的密度梯度，可用于分離各種懸浮的細(xì)胞、線(xiàn)粒體、葉綠體和病毒(可小到70S)。
4．由于Percoll擴(kuò)散常數(shù)低，所形成的梯度十分穩(wěn)定。此外，Percoll不穿透生物膜，對(duì)細(xì)胞害，因此廣泛用于分離細(xì)胞、亞細(xì)胞成分、細(xì)菌及病毒，還可將受損細(xì)胞及其碎片與完好的活細(xì)胞分離。
5．Percoll溶液高壓滅菌，必須進(jìn)行不添加鹽或蔗糖。鹽的存在會(huì)引起percoll糊化，蔗糖的存在會(huì)引起焦糖化。

儲(chǔ)存條件：常溫運(yùn)輸和保存，有效期五年(未開(kāi)封狀態(tài))。

使用方法：
1．不同濃度(密度)Percoll溶液的制備：先用9 份Percoll與1份 8.5％ NaCl或1.5MPBS混合達(dá)到生理性滲透壓，然后用生理溶液(0.85％ NaCl或0.15M PBS)稀釋到所需濃度。

Percoll濃度(％)	70	60	50	40	30	20
比重g/ml	1.090	1.077	1.067	1.056	1.043	1.031

2．不連續(xù)密度梯度Percoll層的制備：先將試管壁用牛血清濕潤(rùn)，除去多余血清，這種預(yù)處理可使逐層疊加的Percoll液平穩(wěn)沿管壁流下，使形成滿(mǎn)意的界面。在制備過(guò)程中一般用長(zhǎng)針頭注射器從高密度向低密度逐層放置，有時(shí)相鄰兩層Percoll 比重相差不大時(shí)，可將Percoll液放入注射器中，小針頭斜面緊貼管壁，任其自然慢慢流下。
3．裝樣：樣品體積和細(xì)胞濃度根據(jù)不同細(xì)胞而異，一般加樣體積不宜過(guò)大，細(xì)胞濃度也不可過(guò)高，否則會(huì)影響細(xì)胞的分離和回收。
4．離心：一般采用離心力為400g，時(shí)間20～25min。由于多層Percoll 之間密度差別不大，因此離心機(jī)加速、降速時(shí)要慢，要平穩(wěn)。
5．取樣：當(dāng)所要分離的細(xì)胞大部分在兩層的界面時(shí)，可逐層去除Percoll液后收集界面部位的細(xì)胞;有時(shí)大部分細(xì)胞位于Percoll 層中,則需要逐層收集。收獲含有Percoll液的細(xì)胞經(jīng)2次洗滌后可供培養(yǎng)或檢測(cè)用。

分離純化細(xì)胞舉例
1．富含NK活性大顆粒淋巴細(xì)胞(LGL)的純化:按順序由下向上逐層加50％、47.5％、45％、42.5％和40％五種不同密度的Percoll,如用10ml 試管(或塑料管)分離,每層Percoll約1.2～1.5ml，初步從外周血中分離的PBMC細(xì)胞1×10８懸于１ml培基中，按要求裝樣、離心和取樣。一般富含NK 殺傷活性的LGL細(xì)胞位于42.5％與45％Percoll界面以及上下二層的Percoll液中。
2．純化淋巴母細(xì)胞和除去死細(xì)胞：分別疊加50％和30％Percoll液。收取經(jīng)PHA(或其它抗原、有絲分裂原)刺激PBMC,或含有較高比例異型的PBMC(如腎綜合征出血熱患者)，按要求裝樣、離心和取樣。位于管底的淋巴細(xì)胞為小淋巴細(xì)胞；兩層Percoll之間為淋巴母細(xì)胞，純度和回收率在80％以上，位于30％Percoll表面是死細(xì)胞。收獲淋巴母細(xì)胞可進(jìn)行表型、結(jié)構(gòu)以及功能的研究。

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