北京百奧萊博供應的AFLP試劑盒僅用于生物化學研究方面，AFLP試劑盒是我司眾多優質基因結構和功能之一，質量堪比同類進口產品，價格非常優惠，目前正熱烈促銷中，恭候您的咨詢訂購。...

特別提示：包括AFLP試劑盒(EcoRI-MseI)在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：AFLP試劑盒(EcoRI-MseI)
英文名稱：AFLP Kit(EcoRI-MseI)
產品貨號：BTN100903
產品規格：1600次

本產品在傳統AFLP-PCR的基礎上經過精心優化而開發。AFLP(amplified fragment length polymorphism)原理是一種結合RFLP和PCR技術特點的、迄今為止zuì有效分子標記分型技術，其原理如下：


產品特點：
1．一站式，足夠50次酶切-連接反應、50次預擴反應和1600次AFLP PCR(PCR按30μL體系計算)，但不包括DNA 純化和帶型分析試劑(如PAGE電泳試劑和銀染試劑)。
2．本系列產品提供EcoRI-MseI 組合，適用于GC含量在50%以上的基因組。對GC含量在50%以下的基因組，需從本公司采購AFLP(EcoRI-TaqI)組合。
3．各種參數都經過優化，一次PCR所得AFLP片段數一般在10-100之間，可重復性好，誤差小于0.6%。
4．本產品適用于基因組在500 Mb-6000Mb的材料(如動物和植物)，對于基因組在50-500Mb的材料(如細菌和真菌)或50Mb以下的材料(如質粒，cosmid，BAC，YAC和PAC等)，需要分別另購專門的+1型預擴引物混合液和+3型EcoRI引物(8 種)AFLP引物對。

試劑盒組成：

成分	規格
酶切-連接Buffer，10×	100μl
EcoRI-MseI酶混合液	100μl
EcoRI-MseI 接頭混合物	1ml
T4 DNA連接酶(1U/μL)	50μl
+0型預擴引物混合液	750μl
PCR Mix 3.0	9ml×3
對照DNA(50ng/μL)	20μl
+2型EcoRI引物(8條)	1ml每種
+3型MseI引物(8條)	1ml每種
TE溶液，pH8.0	10ml
超純水	10ml
說明書	1份

+2型EcoRI引物和+3型MseI引物zuì后堿基的序列

引物名稱	8條引物3′zuì后堿基
+2型EcoRI引物	-AA,-AT,-AG,-AC,-TA,-TT,-TG,-TC
+3型MseI引物	-CAA,-CAC,-CAG,-CAT,-CTA,-CTC,-CTG,-CTT

儲存條件：低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。

自備試劑：Southern級DNA純化試劑，尿素-PAGE電泳套裝，銀染試劑盒。

使用方法：

一、DNA提取(本試劑盒不提供相關試劑)
用戶需要自備50-500ng Southern級別的基因組DNA，用前zuì好預實驗以確保DNA能夠被EcoRI和MseI內切酶徹底切開。

二、限制性酶切和接頭連接反應(本試劑盒足夠50次本反應)
1．在0.2mL離心管中加入設置20μL的限制性內切酶酶切體系：

成分	用量
酶切-連接Buffer，10×	2μl
樣品DNA	50ng(對小基因組材料) 500ng(對大基因組材料) 如果用對照，則用5μL
EcoR I-Mse I酶混合液	2μl
超純水	加水到20μl

2．輕柔混勻并短暫離心后，37℃保溫2小時酶切(若PCR 儀器不帶熱蓋，則必須加50μL自備石蠟油，否則水分會蒸發影響反應。下同)，70℃保溫15分鐘滅活內切酶。
3．在上述酶反應體系中加入20μl EcoRI-MseI 接頭混合物和1μl T4 DNA連接酶，輕柔混勻并短暫離心后，20℃保溫2小時讓接頭跟DNA片段相連。
4．在一個離心管中加入10μl上步得到的連接反應液和90μL TE緩沖液，pH8，充分混勻，得到酶切-連接反應10倍稀釋液，未用完的酶切-連接反應原液(30μL)可放-20℃保存。

三、預擴增(本試劑盒足夠50次本反應)
5．在0.2mL離心管中設置30μl的PCR 體系：

成分	體積
酶切-連接反應液10倍稀釋液	5μl
+0型預擴引物混合液	10μl
PCR Mix 3.0	15μl

6．離心數秒，按下列參數進行PCR預擴增：

	溫度	時間
PCR(20次)	94℃	30s
	56℃	60s
	72℃	60s

7．可以取10μl PCR產物在1.5%瓊脂糖膠上電泳檢測，產物為100-1500bp 模糊條帶。
8．將剩下的預擴反應液用TE 稀釋50倍，直接用于下步反應或放-20℃保存待用。

四、選擇性PCR擴增(本試劑盒足夠至少1600次本反應)
9．在0.2mL PCR 管中，加入下列成分(如果用戶已經知道哪個一種或幾種引物組合適合自己的材料，則直接使用；如果不知道，則需要預先測試所有64 種組合，設置64個PCR反應)，下面只是一種組合：

成分	體積
預擴反應液50倍稀釋液	5μl
+2型EcoR I引物之一(八種之一)	5μl
+3型Mse I引物之一(八種之一)	5μl
PCR Mix 3.0	15μl

10．輕柔混勻后離心數秒，按下列參數進行PCR：

	溫度	時間
PCR(13次)	94℃	30s
	65℃	30s(每次循環遞減0.7℃)
	72℃	60s
PCR(13次)	94℃	30s
	55℃	30s
	72℃	60s
延伸	72℃	5min

五、尿素-PAGE電泳和銀染(需另購試劑并按相關說明書進行)

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名稱：Aspergillosis mRNA原位雜交試劑盒
貨號：ZN0098
規格：100T
基本信息：
保存條件：4℃保存一年
工作量：100張切片。
有效期：一年。
適用種屬：human
標記方式：3’—尾段標記
試劑盒中內容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.預雜交液 2ml；
3.Aspergillosis mRNA原位雜交試劑盒寡核苷酸探針雜交液 2ml；
4.封閉液 5ml；
5.生物素化鼠抗地高xīn 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化過氧化物酶 5ml。
用戶自備試劑：
原位雜交專用蓋玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
緩沖液(3%檸檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位雜交用 PBS)
一．培養細胞和冰凍切片
準備工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%檸檬酸——100ml蒸餾水中加檸檬酸(C6H8O7?H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸餾水中加氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉(C6H5O7Na3?2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸餾水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸餾水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸餾水即可。
原位雜交用PBS(1000ml蒸餾水加氯化鈉30g,Na2HPO4?12H2O 6g,NaH2PO4?2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及時固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC處理，以抑制RNA酶對mRNA的分解作用。此外，過度固定對原位雜交有明顯的不利影響。
1．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．細胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進行培養，條件為37℃和5%的CO2，所用培養基為Dulbecco基礎培養基。細胞長好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。
3．培養細胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 20--30分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+純甲醇50份混合，室溫處理30分鐘。蒸餾水洗滌3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化5—120秒鐘。有時也可以不消化。原位雜交用 PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。
7．預雜交：濕盒的準備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時。吸取多余液體，不洗。
8．雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據雜交情況可以調節)。
9．雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。
10.滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗
11.滴加生物素化鼠抗地高xīn：37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
12.滴加SABC：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
13.滴加生物素化過氧化物酶：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。
14.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒—1ml蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C各一滴，混勻，加至標本上。一般顯色20-30分鐘。若無背景出現則可繼續顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。
15.必要時蘇木素復染，充分水洗。
16.酒精脫水，二甲苯透明，封片。
二．石蠟切片
如果有條件的話，應盡可能地采用新鮮標本。標本離體后，及時予以固定。固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。標本較大時用刀片切成厚度不超過4mm的小塊，固定1小時即可，較大的標本固定不要超過2小時。某些組織對過度固定尤其敏感，如動物大腦，固定時間30-40分鐘，一般不要超過1小時。
1．常規脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。
3．石蠟切片經常規脫蠟至水。30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合,室溫5-10分鐘以滅活內源性酶。蒸餾水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化3--30分鐘(視標本新舊、厚薄自行調整)。用戶可以比較不同的消化時間，例如5分鐘,10分鐘，20分鐘，30分鐘。以找到zuì佳的消化時間。原位雜交用PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。其余步驟和冰凍切片6-16步相同。
結果觀察：
Aspergillosis的細胞胞漿著色呈棕黃色。
注意事項：
由于特定的mRNA序列僅占總mRNA的少數，加上基因僅由四個堿基排列組合而成，因此原位雜交容易出現非特異性染色。通過不加探針和用陰性標本做對照，基本可以確定染色是否為特異性的。有明顯的非特異性染色現象時，用預雜交液對含探針的雜交液進行稀釋，一般稀釋2—10倍；并應加強探針雜交后的洗滌。如果有少量的細胞核著色屬于正常情況；如果出現大量的細胞核著色，往往和標本固定時間過長有關，應重新處理標本。

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