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價格：電議
所在地：北京
型號：HR0197-50T
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更新時間：2023-05-31
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王欣(女士) （來電時請說是從給覽網看到我的)
使用方法：
1、提取液制備：
每500μL絲狀真菌蛋白提取液中加入2μL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。
【注】：
● 根據需要處理的樣品數量準備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。
● 加過蛋白酶抑制劑的提取液一周內未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。
● 以下步驟中使用的蛋白提取液為此步配制好的含蛋白酶抑制劑的提取液。
2、取培養絲狀真菌，在4℃，3000×g條件下離心5-10分鐘，小心吸取培養基，盡可能吸干，收集菌體。
3、用冷PBS洗滌細胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。
4、將菌體置于研缽中用液氮研磨15分鐘左右至粉末。
【注】：
● 若無液氮研磨條件，可直接用蛋白提取液研磨。
● 或者加入蛋白提取液后用勻漿機/勻漿器充分勻漿處理。
5、研磨后，每100mg菌體中加入300-500μL蛋白提取液，混勻后，置離心管中在4℃條件下振蕩20-30分鐘。
【注】：
● 使用振蕩器/搖床的較低轉速，提取液能輕微晃動即可。
● 沒有振蕩條件也可以不振蕩，稍微延長提取液的處理時間，中間每隔幾分鐘用移液器吹打混勻即可。
● 細胞壁較厚的樣本需要進一步延長振蕩時間。
6、在14000×g條件下離心15分鐘。
7、快速將上清吸入另一預冷的干凈離心管，即可得到真菌總蛋白。
8、將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存備用或直接用于下游實驗。
【注】：
● 建議用BCA法進行蛋白定量。
● 蛋白樣品-80℃存放一年沒有問題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細菌污染。
常見問題分析：
● 用什么方法定量蛋白？
建議用BCA法。不適合用Bradford法，因為試劑A中含有干擾Bradford法的組份，導致定量不準。如果已經進行過透析處理或者用脫鹽柱改換過緩沖體系，則可以用Bradford法定量。
● 蛋白濃度低？
處理部分組織樣本時可能沒有裂解完全,導致蛋白濃度低。只要適當延長試劑A的處理時間即可。最好在持續振蕩的條件下處理,沒有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。
試劑A用量可以根據情況進行調整，樣本較小時減少試劑A每次用量。
● 提取時出現膠狀沉淀？
蛋白提取液處理產物中有時會出現少量透明膠狀物,屬正常現象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復合物。不檢測和基因組DNA結合特別緊密的特定蛋白的情況下,可以直接離心取上清進行后續實驗即可；如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白,則可以通過超聲處理,300w/10秒間隔10秒,超聲3分鐘,隨后離心取上清用于后續實驗。檢測一些常見的轉錄因子,例如NF-kappaB、p53等時,不必進行超聲處理。
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