人纖連蛋白(FN)酶聯免疫吸附測定試劑盒使用說明書

                                                                                 
本試劑盒僅供體外研究使用、不用于臨床診斷!
預期應用
ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關生物液體中FN含量。

實驗原理
用純化的FN抗體包被微孔板，制成固相載體，往微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的FN抗體、HRP標記的親和素，經過徹底洗滌后用底物(TMB)顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的FN呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度( 值)，計算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制
1、 酶標板：一塊(96孔)
2、 標準品(凍干品)： 2瓶，請臨用前15分鐘內配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為40 ng/ml，將其稀釋為10 ng/ml后，再做系列倍比稀釋(注：不要直接在板中進行倍比稀釋)，分別配制成10 ng/ml，5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.312 ng/ml，0.156 ng/ml，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 ng/ml。如配制5 ng/ml標準品：取0.5ml (不要少于0.5ml )10 ng/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
6、 檢測溶液A：1×120  /瓶(1:100)。臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋(如：10  檢測溶液A / 990 檢測稀釋液A)，充分混勻，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制(100 /孔)，實際配制時應多配制  0.1-0.2ml。
7、 檢測溶液B：1×120  /瓶(1:100)。臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
8、 底物溶液：1×10ml/瓶。
9、 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10、終止液：1×10ml/瓶(2 mol/L H2SO4)。
11、覆膜：5張
12、使用說明書：1份

自備物品
1、 酶標儀(建議儀器使用前提前預熱)
2、 微量加液器及吸頭，EP管
3、 蒸餾水或去離子水，濾紙

標本的采集及保存
1、 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4 過夜后于1000 g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20 或-80 保存，但應避免反復凍融。
2、 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于 1000 g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20 或-80 保存，但應避免反復凍融。
3、 其它生物標本：請1000 g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20 或-80 保    存，但應避免反復凍融。
4、 樣本處理：血清或血漿標本推薦稀釋5,000-10,000倍。標本使用0.1 M 的PBS稀釋( PH=7.0-7.2)。
 
注：以上標本均應密封保存，4 保存應小于1周，-20 不應超過1個月，-80 不應超過2個月；標本溶血會影響后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

操作步驟
實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫，試劑不能直接在37 溶解；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應預測樣品含量，如樣品濃度過高時，應對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應的稀釋倍數。
1、 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液 100  ，余孔分別加標準品或待測樣品100 ，注意不要有氣泡，加樣 時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37 溫育2小時。為保證實驗結果有效
性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2、 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100 (臨用前配制)，酶標板加上覆膜，37 溫育1小時。
3、 棄去孔內液體，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400 /每孔，甩干(也可輕拍將孔內液體拍干)。
4、 每孔加檢測溶液B工作液(臨用前配制)100 ，加上覆膜，37 溫育1小時。
5、 棄去孔內液體，甩干，洗板5次，方法同步驟3。
6、 每孔加底物溶液90 ，酶標板加上覆膜37 避光顯色(反應時間控制在15-30分鐘，當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止)。
7、 每孔加終止溶液50 ，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物    液的加入順序相同。
8、 立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度( 值)。

注：
1、 試劑準備：所有試劑在使用前應平衡至室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。
2、 加樣：加樣或加試劑時，一個孔與后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的 “預溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。一次加樣時間(包括標準品及所有樣品)控制在10分鐘內。推薦設置復孔進行實驗。
3、 溫育：為防止樣品蒸發，實驗時將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內，以避免液體蒸發；洗板后應盡快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態；同時應嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。
4、 洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響后的酶標儀讀數。
5、 試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據所需的量配制使用，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆。請精確 配制標準品及工作液，盡量不要微量配制(如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10 )，以避免由于不準確稀  釋而造成濃度誤差；請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液。
6、 反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化(比如，每隔10分鐘)，如顏色較深，請提前加入終止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數。
7、 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
    
洗板方法
1、 手工洗板方法：將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內，浸泡1-2分鐘，吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；根據需要，重復此過程數次。
2、 自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性
    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人FN，且與其它相關蛋白無交叉反應。

計算
  各標準品及樣本  值扣除空白孔  值后作圖(七點圖)，如設置復孔，則 應取其平均值計算。以標準品的濃度為縱坐標(對數坐標)， 值為橫坐標(對數坐標)，在對數坐標紙上繪出標準曲線。推薦使用專業制作曲線軟件進行分析，如 curve expert 1.3，根據樣品 值，由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與  值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的  值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

檢測范圍：0.156 ng/ml - 10 ng/ml，繪制標準曲線請取用以下濃度值：10 ng/ml，5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.312 ng/ml，0.156 ng/ml。

zui低檢測限：0.039 ng/ml

說明
1. 在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發和污染，試劑避免受到微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現錯誤的結果。
2. 小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。請注意在吸取標本 / 標準品，酶結合物或底物時，一個孔與后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的 “預孵育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。而且，洗滌不充分將影響試驗結果。
3. 試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃，部分試劑保存于2-8℃，具體以標簽上的標示為準。
4. 濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
5. 剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實驗結果造成任何影響。
6. 中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。
7. 所有的樣品都應管理好，按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。
8. 有效期：6個月