【試劑盒組分】
【樣本處理及要求】
1. 血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。
4.細(xì)胞培養(yǎng)上清：取細(xì)胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測。
5.其它生物樣品：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。
6.樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。
7.樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測的可保存于2-8℃，若不能及時(shí)檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃(1個(gè)月內(nèi)檢測)，或-80℃（6個(gè)月內(nèi)檢測），避免反復(fù)凍融。
8.如果您的樣品中檢測物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品高值，請根據(jù)實(shí)際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋（建議先做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定稀釋倍數(shù)）。
樣品稀釋指導(dǎo)：
用戶須估計(jì)樣品待測因子的含量，決定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)，以使稀釋后樣品中待測因子的濃度處于ELISA試劑盒的佳檢測范圍。
為避免樣本中基質(zhì)效應(yīng)的影響，建議樣本少稀釋一倍。
以上方案僅供參考，樣品的稀釋應(yīng)有詳細(xì)記錄。
注：標(biāo)本溶血會(huì)影響后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。
【注意事項(xiàng)】
1．為確保試驗(yàn)結(jié)果的有效性，建議先做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。
2．酶標(biāo)板袋拆封后，盡快將不用的板孔放回，并放入干燥劑，保持酶標(biāo)板干燥。
3．用戶在初次使用試劑盒時(shí)，應(yīng)將試劑盒平衡至室溫，各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。
4，TMB避光保存。
5，洗板過程非常重要，不充分的洗板易導(dǎo)致假陽性。
6．建議所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣本都做雙份檢測。
7．請保持試驗(yàn)過程的連續(xù)性，禁止酶標(biāo)板干燥，因干燥會(huì)使酶標(biāo)板上的生物成分迅速失活。
8．為避免交叉污染，要避免重復(fù)使用手中的吸頭和試管。
9．禁止混用不同批次試劑盒內(nèi)的試劑。
【檢測步驟概要】
1) 準(zhǔn)備所有的試劑和梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品。板條加入300 μl 1×洗液靜置浸泡30 秒。
2) 標(biāo)準(zhǔn)品孔加入 100 μl 2 倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品。空白孔加入 100 μl 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(血清/血漿樣本)或培養(yǎng)基(細(xì)胞培養(yǎng)上清樣本)。
3) 血清/血漿：樣本孔加入 90 μl 1×檢測緩沖液和 10 μl 樣本。細(xì)胞培養(yǎng)上清：樣本孔加入 100 μl 細(xì)胞培養(yǎng)上清。
4) 每孔加入 50 μl 1:100 稀釋的檢測抗體。步驟 2、3、4 在 15 分鐘內(nèi)完成。
5) 封膜，室溫孵育 1.5 小時(shí)。
6) 洗滌 6 次。
7) 每孔加入 100 μl 1:100 稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素。
8) 封膜，室溫孵育 30 分鐘。
9) 洗滌 6 次。
10) 每孔加入 100 μl 顯色底物，避光，室溫孵育 5 - 30 分鐘。
11) 每孔加入 100 μl 終止液。
12) 30 分鐘內(nèi)，在 450 nm 波長檢測 OD 值，參考波長 570 nm 或 630 nm。
【結(jié)果判斷】
1. 以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)， OD值為縱坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 如有設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均值計(jì)算。 以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)， OD值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。亦可以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2. 推薦使用專業(yè)的曲線制作軟件，如curve expert 1.3或1.4，在軟件界面既可根據(jù)樣品OD值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；亦可將樣品的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。
3. 若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測，計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。
