產品名稱：人胰島素樣生長因子結合蛋白1(IGFBP-1)ELISA試劑盒
英文名稱：Human IGFBP-1 ELISA Kit
規格：96T/48T
保存；2-8℃。
特異性：可檢測樣本中的人胰島素樣生長因子結合蛋白1，且與其類似物無明顯交叉反應。
應用：用于人血清、血漿或其他相關生物液體中胰島素樣生長因子結合蛋白1的測定。

實驗原理：
本試劑盒采用的是雙抗體夾心法酶聯免疫吸附檢測技術（ELISA）。測定樣品中人胰島素樣生長因子結合蛋白1水平。向預先包被了抗人胰島素樣生長因子結合蛋白1抗體的酶標孔中，加入標準品和樣本，溫育后，加入生物素標記的抗胰島素樣生長因子結合蛋白1抗體。再與HRP標記的鏈霉親和素結合，形成免疫復合物，再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶，然后加入顯色底物TMB，產生藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。后，在450 nm處測定反應孔樣品吸光度（OD）值，樣本中的人胰島素樣生長因子結合蛋白1濃度與OD值成正比，通過繪制標準曲線計算出樣本中人胰島素樣生長因子結合蛋白1的濃度。

基本參數：
檢測指標：IGFBP-1；IGFBP1；IGF結合蛋白1
檢測范圍：31.2pg/ml～2000pg/ml
特異性：系統和其它細胞因子無交叉反應
敏感性：＜1pg/ml

產品組成：
組分    規格    數量
預包被抗人IGFBP-1抗體的96孔板    96T    1板
重組人IGFBP-1標準品(凍干)    10ng/管    2管
生物素標記抗人IGFBP-1(100X)    100μL    1管
親和素-過氧化物酶復合物(ABC)(100X)    100μL    1管
樣品稀釋液    30mL    1瓶
抗體稀釋液    12mL    1瓶
ABC稀釋液    12mL    1瓶
TMB顯色液    10mL    1瓶
TMB終止液    10mL    1瓶
洗滌緩沖液(25X)    20mL    1瓶
封板膜        4張

保存：2～8℃，有效期6個月。長期不用請置于-20℃可保存1年。

自備器材：
1.標準規格酶標儀。
2.自動洗板機。
3.恒溫箱
4.系列可調節移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，好用多通道移液器。
5.干凈的試管和Eppendof管。
6.用去離子水將25X洗滌緩沖液稀釋25倍，成1X洗滌緩沖液。

注意事項：
1.使用前TMB顯色液應為無色透明溶液，若發現顏色異常，請及時與我司聯系。
2.用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數分鐘，以便試劑集中到管底。
3.要嚴格避免操作過程中酶標板干燥。干燥會使酶標板上生物成份迅速失活。
4.為免交叉污染，要避免重復使用手中的吸頭和試管。
5.禁止混用不同批次試劑盒內的試劑。
6.遠慕生物提供的96孔酶標板是單條可拆型酶標板，用戶可按需求使用；剩余的酶標板請按保存條件貯存。
7.揭封板膜和覆蓋封板膜時應避免用力過大導致液體濺出。

洗板方法：
1.手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將1X洗滌緩沖液至少300μL注入孔內，浸泡1～2分鐘。根據需要，重復此過程數次。
2.自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

樣品準備：
樣品如果不立即分析，應分裝后冷凍保存，且避免反復凍融。
1.血清：用干凈試管收集血液，凝固2小時后離心1000×g 10分鐘，收集血清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。
2.血漿：采用EDTA或肝素抗凝，抽血后30分鐘內離心1000×g 10分鐘。立即分析或分裝后20℃冷凍保存。
3.細胞培養上清、尿液：離心去除沉淀，立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。
4.貼壁細胞：去除培養液，用PBS、生理鹽水或無血清培養液洗一遍。加入適量裂解液，用槍吹打數下，使裂解液和細胞充分接觸。通常10秒后，細胞就會被裂解。
5.懸浮細胞：離心收集細胞，用PBS、生理鹽水或無血清培養液洗一遍。加入適量裂解液，用槍吹打把細胞吹散，用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后，10000～14000g離心3～5分鐘，取上清。立即分析或分裝后-20℃冷凍保存。

樣品稀釋：
用戶須估計樣品待測因子的含量，決定適當的稀釋倍數，以使稀釋后樣品中待測因子的濃度處于ELISA試劑盒的佳檢測范圍。根據待測因子含量高、中、低的不同，分別采取不同的稀釋方案，以下方案僅供參考，樣品的稀釋應有詳細記錄。
1.高：指待測因子在20～200ng/ml。一般按1:100稀釋。297μL樣品稀釋液加3μL樣品。
2.中：指待測因子在2～20ng/ml。一般按1:10稀釋。225μL樣品稀釋液加25μL樣品。
3.低：指待測因子在31.2～2000pg/ml。按1:2稀釋。100μL樣品稀釋液加100μL樣品。
4.特低：指待測因子≤31.2pg/ml。樣品一般不做稀釋，或按1:2稀釋。

試劑準備：
A.人IGFBP-1標準品的稀釋和使用：在使用前2小時內準備。試劑盒提供2管標準品，每管10ng，每次使用1管。
1.配制10,000pg/ml標準品：取1mL樣品稀釋液加入標準品管內，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解。
2.配制2000pg/ml標準品：取0.2mL 10,000pg/ml的標準品加入有0.8mL樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻，做上標記。
3.配制1000pg/ml～31.2pg/ml標準品：準備6只Eppendorf管，每管加0.3mL樣品稀釋液，分別標記上1000pg/ml,500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.2pg/ml。取0.3mL 2000pg/ml的標準品加入標記1000pg/ml的管中，混勻后同樣取出0.3mL，加入下一只管中。余同此類推，直到后一只樣品管。注意：已經稀釋的標準品（10,000pg/ml），應在12小時內使用。-20℃冷凍保存條件下，2天內可以使用，但不得反復凍融。
B.生物素標記抗人IGFBP-1抗體工作液的準備：在使用前2小時內準備。
1.根據每孔需要100μL計算總的用量（實際配制時應多配制100～200μL）。
2.按1μL生物素標記抗人IGFBP-1加抗體稀釋液99μL的比例配制工作液。輕輕混勻。
C.親和素-過氧化物酶復合物（ABC）工作液的準備：在使用前1小時內準備。
1.根據每孔需要100μL計算總的用量（實配時應多配制100～200μL）。
2.按1μL親和素-過氧化物酶復合物（ABC）加ABC稀釋液99μL的比例配制工作液。輕輕混勻。

操作步驟：
已稀釋好的ABC和TMB顯色液在加入酶標板孔前都應預先在37℃中平衡至少30分鐘。試劑或樣品稀釋時，切不可忘記混勻。每次檢測都應該做標準曲線。用戶須估計樣品待測因子的含量，決定適當的稀釋倍數。

1.確定本次檢測所需的已包被抗體的酶標板孔數目，并增加1孔作為TMB空白顯色孔。總數=樣品數+9；做雙份檢測時×2。其余重包裝好放入冰箱中。
2.將2000pg/ml,1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.2pg/ml的標準品各100μL依次加入一排7孔中，1孔只加樣品稀釋液的作為零孔。對于血清、血漿、細胞裂解液、尿液或細胞培養上清，每孔加100μL已用樣品稀釋液稀釋的樣品。
3.酶標板加上封板膜，37℃反應90分鐘。
4.反應后用自動洗板機吸去酶標板內的液體；或甩去酶標板內液體，再對著吸水紙拍幾下。不洗。
5.將準備好的生物素抗人IGFBP-1抗體工作液按每孔100μL依次加入（TMB空白顯色孔除外）。
6.酶標板加上封板膜，37℃反應60分鐘。
7.1X洗滌緩沖液洗滌3次，每次浸泡1分鐘左右（每孔洗液至少300μL）。
8.將準備好的ABC工作液按每孔100μL依次加入（TMB空白顯色孔除外）。
9.酶標板加上封板膜，37℃反應30分鐘。
10.1X洗滌緩沖液洗滌5次，每次浸泡1～2分鐘左右（每孔洗液至少300μL）。
11.按每孔90μL依次加入TMB顯色液，37℃避光反應25～30分鐘。注意：顯色時間供參考，因用戶實驗室條件差異，佳顯色時間會有所不同。此時肉眼可見標準品的前3～4孔有明顯的梯度藍色，后3～4孔差別不明顯。
12.按每孔100μL依次加入終止液，順序同加TMB。此時藍色立轉黃色。
13.用酶標儀在450nm測定O.D.值。有兩種設定空白對照的方案：
①將TMB空白顯色孔(只加TMB顯色液和終止液)設為對照。所有的標準品和樣品的吸光值減去TMB空白顯色孔的吸光值后，在坐標紙上畫出曲線，以吸光值作為縱坐標，以濃度作為橫坐標。
② 將零孔設為對照。所有的標準品和樣品的吸光值減去零孔的吸光值后，得到的數據可以直接在坐標紙上畫出曲線。
14.根據樣品的吸光值在坐標上找出對應的濃度。用戶也可以使用各種應用軟件來計算。應記住由于樣品稀釋了N倍，其實際濃度應該×N。

操作總結：
1.加樣品和標準品，37℃反應90分鐘。不洗。
2.加生物素標記抗體，37℃反應60分鐘。1X洗滌緩沖液洗滌3次。
3.加ABC，37℃反應30分鐘。1X洗滌緩沖液洗滌5次。
4.TMB 37℃反應25～30分鐘。
5.加入終止液，讀數。

參考總結：
取自某些批次質檢數據，僅供參考，用戶需要自己建立標準曲線。
濃度(pg/ml)    0    31.2    62.5    125    250    500    1000    2000
OD值    0.052    0.140    0.225    0.386    0.701    1.134    1.941    2.626