可保種型藍白T載體說明書
產品編號：BTN60803
規格：50ng
產品及特點：
本產品(曾用名:一站式藍白T 載體)是環狀的可以制備克必隆藍白T 載體的質粒DNA。T 載體是克隆PCR 擴增產物的必不可少的工具，但是由于市場上的各種T 載體質量參差不齊，用戶很難購買到滿意的產品；同時購買的T載體為線性DNA，不能保種，必須反復購買，累計成本很高。為解決這一問題，百奧萊博特推出可保種型T 載體，用戶只需要購買Xcm I 內切酶就可以自己制備高質量的T載體，隨用隨配，十分方便。
1. 一次購買，終身擁有。本產品提供制備T 載體用的環形質粒DNA，可以象其他質粒一樣保種并長期保存。
2. 隨用隨配，十分方便。用戶只需要提供Xcm I 限制性內切酶和基本分子生物學實驗條件，就可以自己制備T 載體。整個過程只需要兩天。
3. T 載體含T 率為。本方法不是使用傳統的加尾法，而是使用Xcm I 酶切法。質粒的多克隆位點上預先插入了一段長為1.3 Kb 的Xcm I DNA 片段,經Xcm I 酶切后回收得到的質粒DNA（T 載體）兩端自然全部帶有T 突出，比例遠遠高于用Taq DNA 聚合酶加尾法和TdT 加尾法得到的T 載體。
4. 方便各種下游操作。用本產品得到的藍白T 載體插入位點兩側有多種常見的酶切位點，便于后續克隆； Xcm I 位點在Alpha 互補區，可以使用藍白斑篩選重組子；兩邊還有T7 和SP6 RNA 聚合酶啟動子，便于制備RNA 探針。
格及成分：
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成分 |
規格 |
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藍白T載體(環狀) |
50ng |
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說明書 |
1份 |
保存條件：
低溫運輸，-20℃保存，有效期兩年。
自備試劑：
連接反應試劑。
使用方法：
一. 細菌的轉化
1. 將100 μL感受態細胞于冰上解凍。注意：zui好使用end A1菌種（如DH1、DH5、DH5a、JM109、XL1-Blue等。常用宿主細菌的基因型可以參考《分子克隆手冊》等參考書）。因為這類細菌所含DNase少，制備T載體后，殘留的DNase對的T末端的破壞機會更小。
2. 取5-10 μL本產品加入到感受態細胞中，輕輕旋轉幾次以混勻內容物。在冰上放置30分鐘。
3. 將管放入預加溫到42℃的水浴中，熱休克90秒。快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1～2分鐘。
4. 每管中加900 μL LB培養基，37℃振蕩培養1小時。
5. 取100 μL培養液涂布到含Amp的LB瓊脂平板表面。
6. 將平板置于室溫直至液體被吸收。
7. 倒置平皿，于37℃培養，12～16小時后可出現菌落。
二. 細菌的鑒定
1. 挑取單個菌落進行過夜細菌培養。
2. 按常規的方法進行質粒小量制備。
3. 用Xcm I內切酶按下面條件酶切提取的質粒DNA，如果大規模酶切，需要按比例增加各成分用量:
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成分 |
使用量 |
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Xcm I Buffer,10× |
5μl |
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質粒DNA |
<或= 2 ug |
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Xcm I |
1μl |
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超純水 |
加到50μl |
37℃保溫一小時, 65℃保溫20分鐘使酶失活。
4. 電泳，本產品被Xcm I酶切后將產生3 Kb和1.3 Kb的兩段DNA。
5. 如果Xcm I酶切圖譜正確，則按常規的方法進行細菌的保種。
三. T載體的制備
1. 參考《分子克隆手冊》等參考書培養細菌和提取質粒DNA。注意：一定要去盡可能去除殘留的RNA和蛋白質（含殘留DNase）的污染。
2. 用Xcm I酶切質粒。注意：酶切時間zui好不要超過一小時，避免殘留的DNase對T末端的破壞。
3. 電泳后切下含3Kb DNA（既藍白T載體）的膠段。注意：千萬不要用UV照射將要回收的片段，因為UV會使DNA交連，使DNA失去轉化細菌的能力。如果酶切的DNA量大，可以使用百奧萊博綠如藍核酸染料,可以直接在可見光和黑背景下切膠。如果別無選擇，zui好在長波（360nm）紫外燈下快速切膠，盡可能切掉多余的凝膠。為避免DNA交連，可以使用百奧萊博的DNA防護劑UV Erasol（BTN60601）
4. 用常規DNA回收方法進行膠回收。
5. 測定T載體DNA的濃度后，將T載體DNA保存在-20℃備用或直接使用。
四. 連接反應
1. 短暫離心裝有T載體的離心管。
2. 在兩個離心管中加入下列成分：
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成分 |
樣品管 |
陰性對照管 |
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T4 Ligase Buffer，10× |
1μl |
1μl |
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藍白T載體 |
20-50ng |
20-50ng |
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PCR 純化產物 |
50-500ng |
不加 |
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T4 Ligase |
3-5U |
3-5U |
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補水到 |
10μl |
10μl |
注意: PCR純化產物與藍白T載體的摩爾比zui好為3:1-10:1。
3. 用移液器吹打連接反應使之混勻后，16℃孵育12小時(或按T4 Ligase供貨商提供的操作說明書進行連接)。
五. 細菌轉化和鑒定
1. 取5 μL連接產物進行轉化，具體步驟見本手冊一，zui好使用含X-gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板以便進行藍白篩選。
2. 按經典的質粒提取+酶切或測序鑒定，可以選用的、在插入位點兩側都有酶切位點的酶有BstZ I、EcoR I和Not I。可以使用pUC/M13 Forward和Reverse測序引物測定插入片段的序列。按菌落PCR方法篩選，可選用百奧萊博的菌落PCR試劑盒（BTN50901）進行快速篩選，需要T7和SP6 RNA聚合酶啟動子引物。
