土壤DNA提取試劑盒說明書
產(chǎn)品編號：BTN60701
規(guī)格：50T
產(chǎn)品及特點：
由于土壤中有機質(zhì)含量豐富,尤其是其中的腐殖酸對PCR等后續(xù)反應有大的抑制作用,所以從土壤微生物提取高純度的DNA一直是十分棘手的問題。本產(chǎn)品是百奧萊博精心優(yōu)化的專門用于從各種土壤樣品和河海沉積物中提取高質(zhì)量的DNA的試劑。
1. 去污染效guo好，OD260/280一般都在1.8以上, OD260/340一般都在3.0以上(表示腐殖酸少),得到的DNA樣品原液或稀釋液可以直接用于PCR等后續(xù)反應。
2. 產(chǎn)量高，每克土壤一般可以提取到5 ug 左右DNA，片段長度在30 Kb左右。
3. 操作過程簡單快速，只需要30分鐘。
4. 擴容性好，既可以在1.5 mL離心管中微量提取，也可以在50 mL離心管中進行大規(guī)模制備。
5. 試劑無害, 環(huán)保。
規(guī)格及成分：
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成分 |
規(guī)格 |
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溶液A |
25ml |
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溶液B |
25ml |
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說明書 |
1份 |
保存條件：
常溫運輸及保存，有效期一年。
自備試劑：
氯fang、無水乙醇、75%乙醇。
使用方法：
1. 65℃預熱溶液A，待其沉淀溶化后，充分混勻，取0.5 mL加入到1.5 mL塑料離心管中并放置于65℃待用。
2. 稱取0.1-0.3 g的土壤，加入到含預熱溶液A的離心管中，震蕩器上劇烈震蕩5-10分鐘。如果是擴量操作，可以使用更多土壤和較大離心管。也可以將同一種土壤在較大離心管中震蕩處理，然后再分到1.5 mL離心管中。注意:不論使用大的還是小的離心管，一定要讓管底的土壤震蕩起來。
3. 將離心管置于65℃水浴中保溫至少5分鐘。
4. 13000-15000 g室溫離心3分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到一新離心管中(上清液一般呈淡黃色或深棕色，具體取決于腐殖酸的含量，上清的體積一般為300-400μL)。
5. 在上清液中加入等體積的溶液B，上下顛倒30秒充分混勻，溶液將呈白色或淡黃色混濁狀。
6. 將離心管冰浴至少5分鐘。
7. 13000-15000 g室溫離心3分鐘，轉(zhuǎn)移上清到新的1.5 mL離心管中，上清液顏色將比第4步得到的上清的顏色稍淡，體積在0.7 mL左右。
1. 65℃預熱溶液A，待其沉淀溶化后，充分混勻，取0.5 mL加入到1.5 mL塑料離心管中并放置于65℃待用。
2. 稱取0.1-0.3 g的土壤，加入到含預熱溶液A的離心管中，震蕩器上劇烈震蕩5-10分鐘。如果是擴量操作，可以使用更多土壤和較大離心管。也可以將同一種土壤在較大離心管中震蕩處理，然后再分到1.5 mL離心管中。注意:不論使用大的還是小的離心管，一定要讓管底的土壤震蕩起來。
3. 將離心管置于65℃水浴中保溫至少5分鐘。
4. 13000-15000 g室溫離心3分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到一新離心管中(上清液一般呈淡黃色或深棕色，具體取決于腐殖酸的含量，上清的體積一般為300-400 μL)。
5. 在上清液中加入等體積的溶液B，上下顛倒30秒充分混勻，溶液將呈白色或淡黃色混濁狀。
6. 將離心管冰浴至少5分鐘。
7. 13000-15000 g室溫離心3分鐘，轉(zhuǎn)移上清到新的1.5 mL離心管中，上清液顏色將比第4步得到的上清的顏色稍淡，體積在0.7 mL左右。
8. 加入0.2 mL的氯fang(自備)，震蕩器上充分振蕩30秒混勻。注意:一定要讓管底的溶液震蕩起來。
9. 13000-15000 g室溫離心3分鐘，小心轉(zhuǎn)移上清到新離心管中。說明：離心后兩相交界面將有白色膜狀物，其中有機相部分顏色較深，一般呈淡棕色。上清的顏色取決于土壤中腐殖酸的含量。
10. 重復第8步和第9步一次。zui后將上清轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管時，不要超過0.5 mL，否則沒有空間加兩倍體積的乙醇。如果有多余的可以棄之不用。
11. 加入2倍體積的乙醇(自備)，上下顛倒30秒混勻，15000 g離心5分鐘,棄上清，管底將有微小DNA沉淀，有時候呈棕色。注意：不要用異丙醇代替乙醇，否則腐殖酸更容易于DNA共沉淀。
12. 加入1mL 75%乙醇，震蕩，13000-15000 g室溫離心3分鐘，棄上清。
13. 重復上步清洗一次。注意：75%乙醇洗兩次有助于去除部分腐殖酸。
14. 短暫離心，吸棄殘留的75%乙醇（約50μL），室溫晾干。注意：一定要去除殘留的75%乙醇，否則會影響后續(xù)反應和電泳上樣（樣品會飄走）。
15. 加入30 μL TE緩沖液溶解沉淀。注意：不知道樣品土壤DNA產(chǎn)率前zui好不要加過多TE，如果DNA濃度高，可以再加TE稀釋。
16. DNA即可用于電泳、酶切和PCR等反應。 電泳時zui好采取電泳后染色，因為實驗發(fā)現(xiàn)，殘留腐殖酸會吸附走大量的EB，使在腐殖酸后面的DNA不能染色。
備注：
有用戶反映提淤泥的DNA時，將步驟2中的劇烈震蕩5-10分鐘改成混勻3分鐘，步驟3中的65℃水浴中保溫時間延長到10分鐘，再重復8步，9步一次，可以得到完整清晰明亮DNA條帶。
疑難解答：
Q: 如何判斷提取的ＤＮＡ沒有腐植酸污染？
A：方法一是目測法，即看得到的溶液是否無色。如果呈淡棕黑色或淡黃色，說明可能是少量殘留的未除盡的腐植酸。方法二是檢測zui大光吸收。注意：有腐植酸污染并不表示DNA不能使用，有的腐殖酸并不抑制PCR擴增。
Q: 腐殖酸的zui大吸收波長是多少？
A：腐植酸（humic acid）是一大類呈棕黑色或黑色的物質(zhì),其結(jié)構(gòu)千差萬別，土壤中腐殖酸的組成和特點隨土壤不同而不同，所以其zui大吸收波長也各不相同，有的土壤的腐殖酸在260 nm有zui大吸收（見Appl.Environ. Microbiol., 63：4993, 1997），有的則在340 nm。所以用特定的波長測定OD值時波長的選定要根據(jù)土壤而決定。Sigma, Fluke等公司出售的腐植酸產(chǎn)品成分一般比較簡單，其zui大吸收波長不能推廣到成分更為復雜的土壤腐殖酸樣品。
Q:本產(chǎn)品是否徹底去除土壤DNA中的所有腐植酸?
A: 腐植酸（humic acid）是動、植物的殘骸經(jīng)過微生物的分解、轉(zhuǎn)化和成千上萬年的復雜化學反應而產(chǎn)生的特性各異的一大類物質(zhì)，其含量和種類隨土壤不同而不同。本產(chǎn)品可以從大部分土壤樣品中提取到無腐殖酸污染的DNA。但對于腐殖酸含量特別高的土壤樣品（如泥碳樣品，含70%腐殖酸），可能還需要使用柱式腐殖酸清除劑（BTN60801）以便清除DNA樣品中殘留的腐殖酸。
Q: 是否腐植酸都會抑制后續(xù)的DNA反應？
A：否，因為腐植酸是一大類物質(zhì)的統(tǒng)稱，他們的結(jié)構(gòu)和特性各不相同，所以是否對后續(xù)反應有影響zui好通過實驗來驗證。如果用提取的DNA溶液原液進行反應而反應沒發(fā)生，而對照樣品（已知的不含污染的DNA）能夠發(fā)生，說明可能抑制作用。
Q：如果樣品含有抑制后續(xù)反應的腐植酸，如何去除？
A：如果提取的DNA原液不能擴增，可以將樣品稀釋10倍和100倍再進行PCR，抑制作用一般可以解除。如果仍然抑制，可以使用我公司的PCR Inhibitor Erasol（BTN60804）。如果仍然不能解除，則可以通過柱式腐殖酸清除劑（BTN60801）或先電泳，再用片段膠回收試劑Magic Gel DNABACK（BTN60706）純化土壤DNA，去除殘留抑制劑。其中后兩方法zui有效，得到的原液一般可以直接擴增。
Q：在用土壤DNA進行細菌專一性PCR時，為何沒加DNA模版的陰性對照有擴增產(chǎn)物出現(xiàn)？
A：這是由于使用的Taq DNA聚合酶一般從E.coli表達菌株中提取，提取過程中污染了E.coli的基因組DNA，而使用的廣譜細菌專一性引物可以識別所有細菌DNA基因組DNA模版，所以會產(chǎn)生擴增。建議使用高質(zhì)量的Taq DNA聚合酶。
