血液RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)
產(chǎn)品編號(hào)：BTN3071
規(guī)格：50T/250T
產(chǎn)品及特點(diǎn)：
本產(chǎn)品是專(zhuān)門(mén)從全血樣品中快速提取總RNA的試劑盒，主要用于提取全血細(xì)胞的總RNA(提取血漿病毒RNA 需使用病毒RNAout，提取純化后的白細(xì)胞RNA 可使用動(dòng)物RNA提取試劑盒)。
1. RNA 無(wú)明顯降解和DNA 污染， OD260/280 均在1.9 以上。血液RNA
的產(chǎn)量與動(dòng)物種類(lèi)和動(dòng)物的狀態(tài)(如有疾病與否)有很大關(guān)系，人全血產(chǎn)量為2-6 μg/mL，兔全血產(chǎn)量為5-10 μg/mL。
2. 操作簡(jiǎn)單，直接使用新鮮的或冷凍的抗凝全血樣品，不需裂解紅細(xì)胞等任何預(yù)處理步驟，整個(gè)提取過(guò)程只需要十多分鐘，可以全在室溫下進(jìn)行。
3. 處理量大，每管的樣品處理量可以達(dá)到1.5 mL，高于進(jìn)口的同類(lèi)產(chǎn)品。
4. 與常用的抗凝劑(包括肝素，EDTA，檸檬酸鈉，草酸鈉)兼容，得到的RNA可以直接用于RT-PCR 和Northern 雜交等研究。
規(guī)格及成分：
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成分 |
50T |
250T |
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溶液A |
50ml |
250ml |
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溶液B |
15ml |
75ml |
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溶液C |
25ml |
125ml |
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溶液D |
25ml |
125ml |
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說(shuō)明書(shū) |
1份 |
1份 |
保存條件：
常溫運(yùn)輸，4℃保存，溶液B 和溶液C 有腐蝕性。4℃保存的溶液A 可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀，用前需65℃水浴加熱直到沉淀溶解。有效期一年。
自備試劑：
氯fang，異丙醇，75%乙醇，RNA 溶解液（如液相RNase 清除劑）。
使用方法：
1. 將 0.2-1.5 mL 新鮮或解凍后的抗凝全血加入到1.5 mL 塑料離心管中，15000 g 室溫離心3 分鐘，棄上清(血漿)。如果此時(shí)血液細(xì)胞沉淀體積大于0.2 mL， 則需要減少血液的使用量，具體減少量需根據(jù)具體情況決定，因?yàn)楦鱾€(gè)個(gè)體(尤其是患者)血液中白細(xì)胞數(shù)目差別很大。如果提取0.1 mL 以下的微量血液樣品zui好加入百奧萊博的微量助沉劑RNADOWN。
2. 將 1 mL 溶液A 加入到血液細(xì)胞沉淀中，用移液槍吹打沉淀使細(xì)胞裂解。
3. 將 0.3 mL 的溶液B 和0.2 mL 氯fang加入離心管，劇烈震蕩30 秒。
4. 13000-15000 g 室溫離心5分鐘，將上清液(為無(wú)色或淺紅色，約0.5-0.9
mL)轉(zhuǎn)移到另一干凈離心管中。為防止污染，zui好留100 μL 左右的上清液。下層有機(jī)相一般呈深紅色，中間層為白色，含有DNA，蛋白質(zhì)和其他細(xì)胞破碎物，避免觸及或吸取。
5. 加入 0.5 mL 的溶液C 和0.2 mL 的氯fang到上清液中，用手上下劇烈搖晃30 秒。
6. 13000-15000 g 室溫離心3 分鐘，將上清液(無(wú)色，約1 mL)轉(zhuǎn)移到另一干凈離心管中，避免觸及或吸取有機(jī)相及其上面的白色膜狀物(蛋白質(zhì))。可以按每次吸取100-200 μL 的方式分批轉(zhuǎn)移。
7. 在上清液中加入1/2 體積的溶液D，用手上下劇烈搖晃30 秒，溶液將呈白色渾濁狀。
8. 13000-15000 g 室溫離心5-30 分鐘，小心移棄上清液，避免觸及管底大量的白色RNA 沉淀。
9. 在離心管中加入1 mL 75%乙醇，振蕩器上振蕩混均30 秒。室溫離心13000-15000 g 1分鐘，RNA 此時(shí)在管底形成細(xì)小沉淀。小心吸棄上清液，注意不要吸棄RNA 沉淀。
10. 重復(fù)第9 步的75%乙醇清洗步驟一次。
11. 短暫快速離心數(shù)秒使管壁上殘留液體沉到管底（約50 μL），用移液槍小心吸棄，注意不要吸棄沉淀。此步十分重要，因?yàn)闅埩舻囊掖紩?huì)影響后續(xù)反應(yīng)。
12. 室溫短暫放置2 分鐘，立即加入適量(一般為10-30 μL)溶解液使RNA沉淀溶解。建議使用具有滅活殘留RNase 功能的RNA 溶解液液相RNase Erasol 而不要使用經(jīng)典的DEPC 水。千萬(wàn)不要用真空離心法使RNA 沉淀過(guò)于干燥，否則RNA將變得十分難溶。RNA 樣品可以直接使用，也可以存放于-80℃長(zhǎng)期保存。
疑難解答：
1．有的樣品在第4 步離心后有很厚的中間層，上清很少。原因是蛋白質(zhì)變
性不充分，可以適當(dāng)減少血液的用量。白細(xì)胞多的血液容易產(chǎn)生這種情況。
2．有的樣品在加入溶液D 離心后，沉淀上浮在液面，這是由于液體的比重大于沉淀，可以加入少量的超純水使溶液的比重降低，直到沉淀能下去為止。也可能把下層的有機(jī)相取上來(lái)了，如果這樣需要重做。
3．千萬(wàn)不要用真空離心法使RNA 沉淀過(guò)于干燥，否則將變得十分難溶。
4．無(wú)論使用甲醛變性膠還是非變性膠電泳時(shí)，一定要使用RNA 變性/上樣液（如百奧萊博的RNAON）以讓RNA 充分變性，否則加樣孔中會(huì)有RNA復(fù)合物（人們會(huì)誤以為是DNA污染）。使用沒(méi)有變性能力的DNA 上樣液不能使RNA 復(fù)合物分離。
5．測(cè)OD時(shí)一定要使用pH 8.0 的緩沖液（如TE），不要使用微酸性的DEPC水，否則OD 值會(huì)比真實(shí)的值低15-20%。
