1、試劑盒簡介
貨號：HB-701-2
鯉春病毒血癥（SVC），又名鯉春病毒病，是一種由彈狀病毒引起的主要感染四大家魚和幾種鯉
科魚的病毒性傳染病。主要危害鯉，但也可感染草魚、鰱、鳙、鯽和六須鲇等。鯉是其中敏感的
宿主，又以 1 齡以上的鯉危害為嚴重。該病主要流行于春季，水溫在 13-20℃時流行。本病的主
要病癥是魚群聚集于出水口處，體色發黑，呼吸緩慢，病魚往往失去平衡而側游，有瘀斑性出血，
皮膚及鰓上多見。
為了適應鯉春病毒血癥病毒（SVCV）快速檢測和疫病研究的需要，本公司參考 2015 版 OIE 水生
動物疫病診斷手冊 2.3.8 規定的 SVC 的 RT-PCR 檢測病毒的引物序列及其循環參數和中華人民共和國
出入境檢驗檢疫行業標準《鯉春病毒血癥檢疫技術規范》（SN/T 1152-2011）中規定的技術標準，在
本公司嚴謹的產品質量保證體系管控下生產和質檢，確保本試劑盒滿足 SVC 的檢測標準要求。本試
劑盒具有快速靈敏、特異、準確、安全、操作簡單、應用廣泛等特點及優點。
2、試劑盒組成
試劑盒組成包括核酸擴增試劑。具體組成參見表 1：
表 1：試劑盒組成（50test/盒）
試劑盒組成成分 體積
核酸提取試劑： 核酸裂解液 15ml×2 管
核酸擴增試劑： DEPC 水
SVCV RT-PCR 反應液
酶混合物
陰性對照
SVCV 陽性對照
1ml×1 管
750μL×1 管
60μL×1 管
1ml×1 管
1ml×1 管
（注：核酸提取試劑可使用本公司生產的提取核酸更快捷方便的《病毒 RNA 柱式提取試劑盒》）
3、樣本采集,存放及運輸
3.1 樣本采集：所用取樣器材必須經高壓滅菌并烘干。
取新鮮魚類組織臟器（肝、腦、脾、腎）2g 于已洗凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加 5ml PBS混勻，2 000r/min 離心 10min 取上清轉入無菌離心管中備用。或取有可疑細胞病變的細胞懸液用于檢測。
3.2 存放：研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應不超過 24 h；-70 ℃以下可長期保存，但應避免反復凍融（多凍融 3 次）。
3.3 運輸：采用冰壺或泡沫箱加冰密封進行運輸。
4、一步法 RT-PCR 檢測
4.1 操作方法
4.1.1 樣本的處理（在樣本制備區進行）：
4.1.1.1 取 n 個滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管，其中 n 為被檢樣品、陽性對照與陰性對照的和（陽性
對照、陰性對照在試劑盒中已標出），做標記。
4.1.1.2 每管加入 600 ?L 裂解液，分別加入被檢樣本、陰性對照、陽性對照各 200 ?L，一份樣本
換用一個吸頭，混勻器上振蕩混勻 5 s（不能過于強烈，以免產生乳化層，
也可以用手顛倒混勻），于 4℃ 12 000 r/min 離心 15 min。
4.1.1.3 取與 4.1.1.1 相同數量滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管，加入 500 ?L 異丙醇（-20℃預冷），
做標記。吸取 4.1.1.2 各管中的上清液轉移至相應的管中，上清液應至少吸取 500?L，不能吸
出中間層，顛倒混勻。
4.1.1.4 于 4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉軸方向放置），小
心倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)；加入 600 ?L 75％
乙醇，顛倒洗滌。
4.1.1.5 于 4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉軸方向放置），小
心倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體（不同樣品須在吸水紙不同地方沾干）。
4.1.1.6 4 000 r/min 離心 10s（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉軸方向放置），將管壁上的殘余
液體甩到管底部，小心倒去上清，用微量加樣器將其吸干，一份樣本換用一個吸頭，吸頭不要
碰到有沉淀一面，室溫干燥 3 min，不能過于干燥，以免 RNA 不溶。
4.1.1.7 加入 11 ?L DEPC 水，輕輕混勻，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 離心 5 s，冰上保存備
用。提取的 RNA 須在 2 h 內進行 PCR 擴增；若需長期保存須放置-70 ℃冰箱內。
【也可參照《病毒 RNA 柱式提取試劑盒說明書》（貨號：HB-QPCR-01）使用，更方便快捷提取
核酸】。
注：提取的 RNA 須在 2 h 內進行 PCR 擴增；若需長期保存須放置-70 ℃冰箱內。
4.2、試劑準備
4.2.1 擴增試劑準備（在反應混合物配制區進行）：
從試劑盒中取出相應的一步法RT-PCR反應液、RT-PCR混合酶，在室溫下融化后，2 000 r/min
離心5 s。設所需一步法RT-PCR檢測總數為n，其中n為被檢樣品、陽性對照與陰性對照的和，每個樣
品測試反應體系配制見下表2。
表 2 每個樣品測試反應體系配制表
試劑 RT-PCR 反應液 RT-PCR 混合酶
用量 15 μL 1.0 μL
根據測試樣品的數量計算好各試劑的使用量，加入到適當體積試管中，充分混合均勻，向每個
一步法RT-PCR管中各分裝15 μL，轉移至樣本處理區。
4.2.2 加樣（在樣本處理區進行）：
在各設定的一步法RT-PCR管中分別加入上述樣本處理步驟4.1.1.7中制備的RNA溶液各10μL，蓋
緊管蓋，500 r/min離心30s。
4.3、檢測（在檢測區進行）：
將4.2.2中離心后的PCR管放入PCR檢測儀內，記錄樣本擺放順序。循環條件設置如下：
一階段：42 oC/30 min；
第二階段：95oC/2 min；
第三階段：94oC/1 min, 55oC/1 min，72 oC/1min, 40個循環；
第四階段，72 oC/10 min；
第五階段，4oC 保存
4.4、瓊脂糖電泳
用電泳緩沖液制備1.5%的瓊脂糖凝膠平板。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好淹沒膠面。將樣品PCR擴增產物和相應電泳上樣緩沖液（Loading Buffer）按比例混勻后加入樣品孔。在電泳時設立DNA標準分子量作對照。5 V/cm電泳約0.5 h，當溴酚藍到達底部時停止。在紫外燈下或凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴增初預期的特異性DNA電泳帶，拍攝并記錄。
5、結果判定
5.1 SVCV一步法RT-PCR后陽性對照出現一條714 bp的DNA片段。陰性對照和空白對照沒有該核酸帶。
5.2 待測樣品在相應 714 bp DNA 位置上有帶，可判陽性。無帶的樣品需要通過嵌套反應進行進一步確認。
6、相關技術信息
引物序列
SVCV F：5’-TCT-TGG-AGC-CAA-ATA-GCT-CAR*-R*TC-3’
SVCV R：5’-AGA-TGG-TAT-GGA-CCC-CAA-TAC-ATH*-ACN*-CAY*-3’
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