志賀氏菌熒光 PCR 檢測試劑盒說明書
1、 試劑盒簡介
貨號：HB-1131-1
志賀氏菌屬(Shigella)即通稱的痢疾桿菌，為革蘭氏陰性菌。志賀氏菌傳染源主要為病人和帶菌
者,通過污染了痢疾桿菌的食物、飲水等經(jīng)口感染，是人類細菌性痢疾為常見的病原菌。
為了適應志賀氏菌快速檢測和疫病研究的需要，本公司參考 2007 年質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局
發(fā)布的中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準（SN/T 1870-2007）《食品中致病菌檢測方法-實時
PCR 法》中規(guī)定的引物和探針序列，經(jīng)多次實驗及系統(tǒng)優(yōu)化，開發(fā)生產(chǎn)了本試劑盒。應用本試劑盒
進行檢測具有快速、靈敏、特異、準確、安全操作簡單、應用廣泛和高通量檢測等特點及優(yōu)點。
2、試劑盒組成
試劑盒具體組成如下（50 test/盒）：
組成成分 體積
DEPC 水
志賀氏菌熒光 PCR 反應液
Taq 酶(5 U/uL)
陰性對照
志賀氏菌熒光陽性對照
5 mL×1 管
800 μL×1 管
30 μL×1 管
1 mL×1 管
1 mL×1 管
*保存條件：試劑盒須在-20℃保存。
3、樣本采集，存放及運輸
3.1 樣本采集：無菌稱取樣品25 g，加入裝有225 mL志賀氏菌增菌肉湯的均質(zhì)杯中，8,000 r/min均質(zhì)
1 min，42℃厭氧培養(yǎng)16-20 h。取培養(yǎng)好的細菌涂于MAC瓊脂平板，37℃培養(yǎng)20~24 h，取長出的
菌落接種于增菌培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)20~24 h備用。
3.2存放：樣本在2 ℃-8 ℃條件下保存應不超過24 h；加入15%-20%甘油可于-70 ℃以下長期保存。
3.3 運輸：密封運輸，嚴防泄露污染。
4、檢測步驟
4.1 DNA 核酸提取操作方法(在樣本處理區(qū)進行)：
4.1.1 待檢樣品增菌處理后，取 n 個 1.5 mL 滅菌 Eppendorf 管，其中 n 為待檢樣品數(shù)、一管陽性對照
和一管陰性對照之和，對每個管進行編號標記，加入對應樣品 1 mL；
4.1.2 于 8,000 r/min 離心 5 min，去上清；
4.1.3 加入滅菌生理鹽水洗滌 2 次，后用 1 mL 滅菌生理鹽水懸浮；
4.1.4 將樣品于置于 100℃干浴或沸水浴 5 min，12,000 r/min 離心 5 min，
4.1.5 吸取上清，即為提取的 DNA，冰上保存待用（提取的 DNA 需在 2 h 內(nèi)進行 PCR 擴增或放置
于-70℃冰箱內(nèi)保存）。
注：細菌核酸提取可選配細菌 DNA 柱式提取試劑盒（貨號：SK-CE-1），效果更好。
4.2 熒光 PCR 檢測
4.2.1 擴增試劑準備（在反應混合物配制區(qū)進行）：
從試劑盒中取出相應的熒光 PCR 反應液、Taq 酶，2,000 g 離心 5 s。每個樣品測試反應體系配
制見下表。
試劑 熒光 PCR 反應液 Taq 酶 合計
用量 14.5 μL 0.5 μL 15 μL
4.2.2 加樣（樣本處理區(qū)進行）：
向每個熒光PCR管孔中各分裝15 μL的混合液，再分別加入樣本DNA模板10μL，蓋緊管蓋，
500 r/min 離心 30 s。
4.2.3 PCR 檢測（在檢測區(qū)進行）：
循環(huán)條件設置：一階段，95℃/3 min；
第二階段，95℃/5 sec，60 ℃/40 sec，40個循環(huán)，在第二階段每次循環(huán)的退火延伸時
收集FAM熒光。試驗檢測結束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結果。
5、結果判定
5.1 結果分析條件設定
直接讀取檢測結果。閾值設定原則根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性樣
品擴增曲線的zui高點為準。
5.2 質(zhì)控標準
陰性對照無擴增曲線、無 Ct 值或Ct 值≥40。
陽性對照的 Ct 值應<30，并出現(xiàn)典型的擴增曲線。否則，此次實驗視為無效。
5.3 結果描述及判定
陰性: 陰性對照無擴增曲線、無 Ct 值或Ct 值≥40，示樣品中無志賀氏菌。
陽性: Ct值≤35，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，示樣品中存在志賀氏菌。
有效原則:40＞Ct>35的樣本建議重做。
6、相關技術信息
F：5’-CGCAATACCTCCGGATTCC-3’
R：5’-TCCGCAGAGGCACTGAGTT-3’
PROBE: 5’-FAM-AACAGGTCGCTGCATGGCTGGAA-TAMRA-3’
- 會員指數(shù):
- 企業(yè)認證:
- 聯(lián)系人:劉小姐(女士)
- 地區(qū):上海
-
