細胞活化與細胞復蘇
發(fā)布時間：2015-11-05瀏覽次數(shù)：886返回列表
細胞復蘇的原則－快速融化：
必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。
具體操作
一. 實驗前準備：
1.將水浴鍋預熱至37℃
2.用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。
3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。
二．取出凍存管：
1.根據(jù)細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。
2.從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。
三．迅速解凍：
1.迅速將凍存管投入到已經(jīng)預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。
2.約1-2min后凍存管內液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內。
四.平衡離心：用架盤天平平衡后，放入離心機中3000r/min 離心3min
五.制備細胞懸液：
1.吸棄上清液。
2.向離心管內加入10ml培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液。
六.細胞計數(shù)：細胞濃度以5×105/ml為宜。
七.培養(yǎng)細胞將復合細胞計數(shù)要求的細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內，將培養(yǎng)瓶放入37℃和5％CO2的培養(yǎng)箱內2-4小時（或者24-48小時）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時間由細胞情況而定。
初學者易犯錯誤：
1水浴鍋未預熱或者未預熱到37℃。
2.水浴鍋內凍存管太多，導致傳熱不佳，使融化時間延長。
3.離心前忘記平衡，導致離心機損壞和細胞丟失。
4.一次復蘇細胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導致細胞交叉污染。
（另：冷凍細胞解凍程序）
2.1. 依據(jù)細胞株數(shù)據(jù)單之基礎培養(yǎng)基種類、血清種類和其它之成份和比例， 制備培養(yǎng)基。大多數(shù)之細胞均無法立即適應不同之基礎培養(yǎng)基或不同之血清種類， 若因實驗需要， 必須有所不同時， 務必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成， 確定細胞適應后， 方進行所需之實驗。
2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 馬血清)，對細胞而言差異大，請務必依據(jù)細胞株資料單之血清種類培養(yǎng)之。
2.3. 將培養(yǎng)基置于 37 °C水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之， 移入無菌操作臺內。取出冷凍管， 立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 水面高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿， 否則易發(fā)生污染。輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化后， 以70 % ethanol 擦拭冷凍管外部， 移入無菌操作臺內。
2.4. 依據(jù)細胞種類和濃度，于無菌操作臺內取 10 ml培養(yǎng)基加至 T25或 T75 flask中。取出已解凍之細胞懸浮液，緩緩加入T25 或T75 flask 內之培養(yǎng)基， 混 合均勻，放入37 °C，5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
2.5. 對大多數(shù)細胞而言，1 % 以下之冷凍保護劑DMSO，不會對細胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細胞中去除，待第二天確定細胞生長或貼附良好后再去除即可。唯對少數(shù)因對DMSO 敏感或會造成細胞分化之細胞，需立即去除DMSO 者， 則可將解凍后之細胞懸浮液放入5 - 10 ml 培養(yǎng)基中,離心300 xg (約1000 rpm)，5 分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基，將細胞均勻混合后， 轉移至培養(yǎng)瓶中， 再放入37 °C， 5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。收到T25 flask 細胞時， 處理方式為︰
1. 于寄送過程中，為避免起泡造成細胞脫落死亡，T25 flask 均加滿培養(yǎng)基。請檢查flask 外觀，并于顯微鏡下觀察細胞生長狀況和有無污染現(xiàn)象，若有任何問題， 不要打開蓋子，請立即通知細胞實驗室。
2. 將原封之T25 flask 靜置于37 °C， 5 % CO2 培養(yǎng)箱中，使細胞回溫至37 °C， 并讓運送過程中少數(shù)脫落的細胞可再附著生長。隔天后，于無菌操作箱內取出flask內之培養(yǎng)基，(取出之培養(yǎng)基可以再使用)，僅留約5-10ml 培養(yǎng)基于flask 內，依 一般培養(yǎng)方式再將細胞置入培養(yǎng)箱中或細胞已長滿盤， 則將細胞做傳代培養(yǎng)。
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