原代細胞的培養
發布時間：2017-04-17瀏覽次數：927返回列表
步. 仔細閱讀產品說明書
因不同品牌、不同種屬、不同類型的細胞其培養技巧存在些許差別，客戶收到細胞后，請務必仔細閱讀隨貨附贈的說明書，切記不可僅憑經驗操作。
通常，我們可以從說明書中獲取以下重要信息：
（1）細胞數目
（2）細胞增殖能力
（3）推薦培養基、培養器皿及包被材料（Coating Solution）
（4）推薦接種密度
（5）復蘇、培養、傳代等操作步驟
（6）運輸及儲存條件
第二步. 細胞復蘇及原代培養
細胞復蘇是關系后續細胞培養成功與否的關鍵步驟。不同品牌、不同種屬的凍存原代細胞在復蘇時可能有所不同，請嚴格按照說明書進行操作。
1. 選擇合適的培養器皿，使用coating solution（poly-L-lysine、Fibronectin等，see the datasheet for specific details）進行包被，并置于37℃, 5% CO2/95% air培養箱中平衡過夜（至少1小時）。
2. 小心將裝有細胞的凍存管從液氮罐取出，注意保護手和眼睛。
3. 將凍存管的蓋子擰松1/4圈，等待10秒，釋放蓋子內可能殘留的液氮，然后重新旋緊蓋子。
4. 將凍存管置于37℃水浴鍋內（注意不要把凍存管完全浸沒在水中），輕搖凍存管直至內容物幾乎完全溶解（只剩一些非常小的冰晶殘留在管內）。此過程大約需要1-2分鐘。
注：水浴融化時間過長會給細胞帶來損傷，導致不貼壁。
5. 迅速將凍存管自水浴鍋中取出擦干，用70%酒精擦拭凍存管外表面，然后轉移至超凈臺內。
6. 在超凈臺內擰開凍存管的蓋子，小心手指不要碰到管口，用1ml移液槍輕輕吹打重懸內容物，然后加入10倍以上內容物體積的培養液制成細胞懸液。
注：復蘇后的內容物含有凍存液DMSO殘留，不同品牌對待是否有必要離心去除DMSO殘留這一問題意見不一，請務必嚴格按照說明書進行操作。
某些品牌，例如Sciencell、Cell Applications等明確規定，不允許將細胞離心以去除DMSO殘留。因為離心過程尤其是高速離心，給細胞造成的危害遠遠大于DMSO殘留給細胞造成的影響。通常，按照說明書上推薦的培養基用量將內容物進行稀釋后，DMSO濃度已經降到很低，不會給細胞造成損傷。
而有些品牌例如ATCC，推薦客戶使用125g離心力離心10分鐘，棄上清，以去除DMSO殘留，然后用1或2ml完全培養基重懸細胞。
7. 按照說明書推薦接種密度將細胞懸液分別加入到若干個事先包被過的培養器皿內。
注：大多數原代細胞培養起始接種密度介于103-104 cells/cm2。對于某些增殖速率較高的細胞類型，通常以較低的接種濃度起始培養。詳細接種密度請參照說明書。
8. 輕輕旋轉培養器皿，使細胞懸液均勻分散開來。
9. 將培養器皿置于37℃, 5% CO2/95% air培養箱培養。
注：大多數動物細胞系的佳生長溫度是37℃，少數對溫度敏感的動物細胞、昆蟲細胞及兩棲類動物細胞的生長需要相對低一點的溫度（例如28℃）。雖然體外培養的細胞能夠承受生存環境溫度驟降，甚至大多數細胞在4℃仍能存活數天，但是少有細胞能夠在高于適宜生長溫度2℃的環境下存活幾個小時。
10. 6-16小時后，次更換培養液，目的是為了去除殘留的DMSO以及未貼壁的死細胞。
11. 之后，視細胞生長情況，每隔2-3天換一次液，詳見datasheet。
