PCR反應異常結果解決攻略
發布時間：2023-08-21瀏覽次數：847返回列表
一、沒有得到擴增產物
（1）酶失活或在反應體系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或運輸不當而失活，往往通過換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結果。
（2）模板含有雜質。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結果。
（3）變性溫度是否準確：PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符，過高酶在前幾個循環就迅速失活；過低則模板變性不徹底。
（4）反應系統中污染了蛋白酶及核酸酶，應在未加Taq酶以前，將反應體系95℃加熱5－10分鐘。
（5）引物變質失效。人工合成的引物是否正確。是否純化，或因儲存條件不當而失活。
（6）使用PCR試劑盒時還應注意：
①是否嚴格按照說明書操作；
②試劑使用前是否充分混勻；
③試劑儲存過久或不當而失效。
二、PCR假陽性結果
（1）引物設計不當，應調換引物。
（2）循環參數不合適，導致非特異性擴增。
（3）靶序列的交叉污染。
三、溴酚藍前有區帶（很寬）
（1）模板量太低。增加模板DNA的用量。
（2）循環次數太多。減少循環次數。
（3）復性度偏低。提高復性溫度。
（4）預變性后沒有立刻上機循環。
（5）引物3'端是否互補；重新設計合成較長的引物。
（6）引物用量偏多。降低引物的使用量。
四、擴增產物出現多條帶
（1）引物用量偏大，引物的特異性不高。應調換引物或降低引物的使用量。
（2）循環的次數過多。適當增加模板的量，減少循環次數。
（3）酶的用量偏高或酶的質量不好，應降低酶量或調換另一來源的酶。
（4）退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長。應提高退火溫度，減少變性與延伸時間，也可采用二種溫度的PCR擴增。
（5）樣品處理不當。
（6）Mg2+濃度偏高，因適當調整Mg2+使用濃度。
（7）若為PCR試劑盒，也可能時試劑盒本身質量有問題。
五、擴增產物在凝膠中涂布或成片狀
（1）酶量過高。減少酶量；酶的質量差，調換另一來源的酶。
（2）dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。
（3）MgCl2濃度過高。可適當降低其用量。
（4）循環次數過多；增加模板量減少循環次數，縮短退火時間及延伸時間，或改用二種溫度的PCR循環。
（5）退火溫度過低。
（6）電泳體系有問題：
①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；
②凝膠沒有凝固好；
③瓊脂糖質量差。
（7）若為PCR試劑盒則可能：
①由于運輸儲存不當引起試劑盒失效；
②試劑盒本身質量有問題，如引物選擇、循環參數等選擇不當。
（8）降解的陳舊模板擴增也易產生涂布。
六、PCR假陰性結果
（1）引物長度不夠。
（2）試劑濃度不標準。
（3）靶序列如突變、缺失等。
（4）循環參數設置錯誤。
（5）標本中有Taq酶抑制劑。
（6）PCR產物檢測系統靈敏度不夠。
