溫度循環參數對PCR反應的影響
發布時間：2022-08-10瀏覽次數：1128返回列表
PCR技術必須有人工合成的合理引物和提取的樣品DNA，然后才進行自動熱循環，后進行產物鑒定與分析。引物設計與合成目前只能在少數技術力量較強的研究院、所進行，臨床應用只需**PCR檢測試劑盒就可開展工作，PCR自動熱循環中影響因素很多，對不同的DNA樣品，PCR反應中各種成份加入量和溫度循環參數均不一致。現將溫度循環參數影響介紹如下。
在PCR自動熱循環中，關鍵的因素是變性與退火的溫度。如操作范例所示，其變性、退火、延伸的條件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30個循環，擴增片段500bp。在這里，每一步的時間應從反應混合液達到所要求的溫度后開始計算。在自動熱循環儀內由混合液原溫度變至所要求溫度的時間需要30～60s，這一遲滯時間的長短取決于幾個因素，包括反應管類型、壁厚、反應混合液體積、熱源（水浴或加熱塊）以及兩步驟間的溫度差，在設置熱循環時應充分給以重視和考慮，對每一儀器均應進行實測。 關于熱循環時間的另一個重要考慮是兩條引物之間的距離；距離越遠，合成靶序列全長所需的時間也越長，前文給出的反應時間是按適于合成長度500bp的靶序列擬定的。下面就各種溫度的選擇作一介紹。
1．模板變性溫度變性溫度是決定PCR反應中雙鏈DNA解鏈的溫度，達不到變性溫度就不會產生單鏈DNA模板，PCR也就不會啟動。變性溫度低則變性不完全，DNA雙鏈會很快復性，因而減少產量。一般取90～95℃。樣品一旦到達此溫度宜迅速冷卻到退火溫度。DNA變性只需要幾秒種，時間過久沒有必要；反之，在高溫時間應盡量縮短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后高變性溫度不宜超過95℃。
2．引物退火溫度退火溫度決定PCR特異性與產量；溫度高特異性強，但過高則引物不能與模板牢固結合，DNA擴增效率下降；溫度低產量高，但過低可造成引物與模板錯配，非特異性產物增加。一般先由37℃反應條件開始，設置一系列對照反應，以確定某一特定反應的適退火溫度。也可根據引物的（G+C）%含量進行推測，把握試驗的起始點，一般試驗中退火溫度Ta(annealing temperature)比擴增引物的融解溫度TTm(melting temperature)低5℃，可按公式進行計算： Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃ 其中A，T，G，C分別表示相應堿基的個數。例如，20個堿基的引物，如果（G+C）%含量為50%時，則Ta的起點可設在55℃。在典型的引物濃度時（如0.2μmol/L）,退火反應數秒即可完成，長時間退火沒有必要。
3．引物延伸溫度溫度的選擇取決于Taq DNA聚合酶的適溫度。一般取70～75℃，在72℃時酶催化核苷酸的標準速率可達35～100個核苷酸/秒。每分鐘可延伸1kb的長度，其速度取決于緩沖溶液的組成、pH值、鹽濃度與DNA模板的性質。擴增片段如短于150bp，則可省略延伸這一步，而成為雙溫循環，因Taq DNA聚合酶在退火溫度下足以完成短序列的合成。對于100～300bp之間的短序列片段，采用快速、簡便的雙溫循環是行之有效的。此時，引物延伸溫度與退火溫度相同。對于1kb以上的DNA片段，可根據片段長度將延伸時間控制在1～7min，與此同時，在PCR緩沖液中需加入明膠或BSA試劑，使Taq DNA聚合酶在長時間內保持良好的活性與穩定性；15%～20%的甘油有助于擴增2.5kb左右或較長DNA片段。
4．循環次數常規PCR一般為25～40個周期。一般的錯誤是循環次數過多，非特異性背景嚴重，復雜度增加。當然循環反應的次數太少，則產率偏低。所以，在保證產物得率前提下，應盡量減少循環次數。 擴增結束后，樣品冷卻并置4℃保存。
