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PCR熱循環(huán)儀半定量RT-PCR的方法步驟
發(fā)布時間:2013-11-27瀏覽次數(shù):1782返回列表

以前用的PCR儀是從離心官底部加熱的,不加入石蠟油的話,本來微量的溶液就會因為水的揮發(fā)而導致體系濃度增高,難以擴增成功。
現(xiàn)在的PCR儀改良了,都是從離心管蓋上邊加熱的,解決了那個麻煩。你可以打開儀器看看的。
過去不用熱循環(huán)儀是需要在所有反應試劑比如:dNTP,MgCl2,Prime等加完后,后在表面加入一層油的,而現(xiàn)在熱循環(huán)儀中不再需要加入,請教長期從事PCR的前輩。
半定量RT-PCR的方法步驟
1.原位PCR步驟
1)預處理:
a.切片常規(guī)脫蠟;
b.2mol/L HCl處理10min;
c.5μg/ml蛋白酶K消化組織37℃10min;
d.Nase消化組織37℃ 30min;
e.梯度酒精脫水,室溫干燥。
2.原位擴增:
a.切片滴加特異性序列引物30μLPCR擴增反應液,覆蓋硅化蓋玻片,石蠟油封邊;
b.PCR熱循環(huán):94℃,1min;55℃,1min;72℃,1.5min,共25~30個循環(huán),72℃延伸10min;
c.氯仿洗去蓋玻片,4%多聚甲醛后固定10min,梯度酒精脫水,干燥。


