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PCR儀如何根據(jù)DNA的擴(kuò)增來(lái)分類
發(fā)布時(shí)間：2013-10-22瀏覽次數(shù)：1059返回列表
DNA在細(xì)胞中的復(fù)制是—個(gè)比較復(fù)雜的過(guò)程。參與復(fù)制的基本因素有：DNA聚合酶、DNA連接酶、DNA模板、由引發(fā)酶合成的RNA引物、核苷酸原料、無(wú)機(jī)離子、合適的pH、以及解開DNA的超螺旋及雙螺旋等結(jié)構(gòu)的若干酶與蛋白質(zhì)因子等。
PCR儀是在試管中進(jìn)行DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理與體內(nèi)相似，不同之處是耐熱的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加熱（變性）、冷卻（退火、保溫（延伸）等改變溫度的辦法使DNA得以復(fù)制，反復(fù)進(jìn)行變性、退火、延伸循環(huán)，就可使DNA擴(kuò)增。
PCR儀的具體過(guò)程如下：
將PCR反應(yīng)體系升溫至95℃左右，雙鏈的DNA模板就解開成兩條單鏈，此過(guò)程為變性。然后將溫度降至引物的Km值以下，3'端與5'端的引物各自與兩條單鏈DNA模板的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合，此過(guò)程稱為退火。當(dāng)將反應(yīng)體系的溫度升至70℃左右時(shí)，耐熱的TaqDNA聚合酶催化四種脫氧核糖核苷酸按照模板DNA的核苷酸序列的互補(bǔ)方式依次加至引物的3'端，形成新生的DNA鏈。每一次循環(huán)使反應(yīng)體系中的DNA分子數(shù)增加約一倍。理論上循環(huán)幾次，就增加為2^n倍。當(dāng)經(jīng)30次循環(huán)后，DNA產(chǎn)量達(dá)2^30拷貝，約為10^9個(gè)拷貝。PCR儀擴(kuò)增過(guò)程見。由于實(shí)際上擴(kuò)增效率達(dá)不到2倍，因而應(yīng)為（1+R）^n，R為擴(kuò)增效率。
根據(jù)DNA擴(kuò)增的目的和檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)，可以將PCR儀分為普通PCR儀，梯度PCR儀，原位PCR儀，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀四類。
1、普通的PCR儀
把一次PCR擴(kuò)增只能運(yùn)行一個(gè)特定退火溫度的PCR儀，叫傳統(tǒng)的PCR儀，也叫普通PCR儀。如果要做不同的退火溫度需要多次運(yùn)行。主要是做簡(jiǎn)單的，對(duì)目的基因退火溫度的擴(kuò)增。該儀器主要應(yīng)用于科研研究，教學(xué)，醫(yī)學(xué)臨床，檢驗(yàn)檢疫等機(jī)構(gòu)。
2、梯度PCR儀
把一次性pcr擴(kuò)增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件(溫度梯度)，通常12種溫度梯度，這樣的儀器就叫梯度PCR儀。因?yàn)楸粩U(kuò)增的不同DNA片段，其適退火溫度不同，通過(guò)設(shè)置一系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增，從而一次性PCR擴(kuò)增，就可以篩選出表達(dá)量高的適退火溫度，進(jìn)行有效的擴(kuò)增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴(kuò)增，這樣節(jié)約成本的同時(shí)也節(jié)約了時(shí)間。主要用于科研，教學(xué)機(jī)構(gòu)。梯度PCR儀，在不設(shè)置梯度的情況下也可以做普通PCR擴(kuò)增。
3、原位PCR儀
用于從細(xì)胞內(nèi)靶DNA的定位分析的細(xì)胞內(nèi)基因擴(kuò)增儀，如病源基因在細(xì)胞的位置或目的基因在細(xì)胞內(nèi)的作用位置等。是保持細(xì)胞或組織的完整性，使PCR反應(yīng)體系滲透到組織和細(xì)胞中，在細(xì)胞的靶DNA所在的位置上進(jìn)行基因擴(kuò)增，不但可以檢測(cè)到靶DNA，又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置，于分子和細(xì)胞水平上研究疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床過(guò)程及病理的轉(zhuǎn)變有重大的實(shí)用價(jià)值。
4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀
在普通PCR儀的基礎(chǔ)上增加一個(gè)熒光信號(hào)采集系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，就成了熒光定量PCR儀。其PCR擴(kuò)增原理和普通PCR儀擴(kuò)增原理相同，只是PCR擴(kuò)增時(shí)加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標(biāo)記，使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合擴(kuò)增。擴(kuò)增的結(jié)果通過(guò)熒光信號(hào)采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)采集信號(hào)連接輸送到計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)得出量化的實(shí)時(shí)結(jié)果輸出。把這PCR儀叫做實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。熒光定量PCR儀有單通道，雙通道，和多通道。當(dāng)只用一種熒光探針標(biāo)記的時(shí)候，選用單通道，有多熒光標(biāo)記的時(shí)候用多通道。單通道也可以檢測(cè)多熒光的標(biāo)記的目的基因表達(dá)產(chǎn)物，因?yàn)橐淮沃荒軝z測(cè)一種目的基因的擴(kuò)增量，需多次擴(kuò)增才能檢測(cè)完不同的目的基因片段的量。該儀器主要用于醫(yī)學(xué)臨床檢測(cè)，生物醫(yī)藥研發(fā)，食品行業(yè)，科研院校等機(jī)構(gòu)。
