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如何走出選擇熒光定量PCR儀誤區
發布時間：2013-09-23瀏覽次數：1118返回列表
熒光定量PCR 因操作方便、運行速度快、實驗結果準確，受到越來越多的分子生物學研究者青睞。在實驗技術成熟的今天，也許對你來說，難得不是實驗技術上的問題——而是選擇哪一種熒光定量PCR儀——你要征詢實驗室成員的意見、分析實驗室目前乃至將來的需求、平衡實驗室的預算，要詳細研究各種富誘惑力的宣傳資料。面對各種不同性能的產品，您又該如何選擇呢?
先建議大家走出認識熒光定量PCR的兩個誤區：
誤區一：儀器通道越多越好
隨著PCR技術的成熟運用，多重擴增越來越熱鬧，熒光定量PCR儀也不能幸免。從初ABI公司推出的單通道熒光定量PCR儀發展到如今各個廠家都推出4通道、5通道甚至6通道熒光定量PCR儀，眼花繚亂的選擇讓人無所適從，就有人一不小心走進了“通道越多越好”的誤區。
在使用有些廠家5通道的熒光定量儀時，為了確保實驗結果的性和準確性都要在實驗中使用ROX(一種熒光染料)或專用的Referencedye，這些熒光染料都必須單獨使用一個檢測通道。這樣以來，真正能檢測多重PCR熒光信號的有效通道只有4個，而且使用校正染料可能會增加后期的使用成本。有的熒光定量PCR的檢測通道是只為自已廠家的專用的熒光染料或試劑開放的，有效檢測通道也非像宣傳資料中宣稱的那么多。在購買前確認熒光定量PCR儀器的有效檢測通道尤為重要，不能單單只聽宣傳。
考慮多重熒光定量PCR的通道數的時候也應該從實驗室實際情況出發，多重PCR并非人人適用、人人可用，因為它使實驗復雜化了。
誤區二：real-timePCR儀無需梯度功能
對于使用染料法的定量PCR反應，雖然有各種各樣的PCR引物設計軟件或者經驗公式計算熔解溫度(Tm 值)，但運用的公式不同、引物序列不同，Tm值的差異會很大。引物的熔解溫度決定了退火溫度。而且模版中堿基的組合千變萬化，對于特殊片斷，經驗公式得到的數據不一定能得出準確的結果，退火溫度細微的差異對結果都可能產生決定性的影響，因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現部分解決了一些問題——在反應過程中每個孔的溫度控制條件可以在范圍內按照梯度變化，根據結果，一步就可以摸索出適合的反應條件。
不單退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以優化——對于多種聚合酶混合酶擴增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數高保真Taq酶來說這個非常重要，因為Taq和校正酶的佳反應溫度可能有顯著差異，優化延伸溫度就顯得很重要。
使用有梯度功能的熒光定量PCR可以一次完成以往多次實驗才能完成的優化過程，簡化了摸索PCR反應條件的繁瑣實驗，既節省實驗時間提率，又節省實驗成本。
當我們走出誤區，想要選擇一款適合自己需求的熒光定量PCR儀時我們又該關注些什么呢?
1、 儀器的檢測通量
在購買定量PCR儀的時候要根據實驗實的需要來選擇不同通量的儀器。目前市面上的熒光定量PCR的檢測通量小到16個多到384個。如果進行一般的基因表達研究或病原體檢測，實在不必購買昂貴的儀器，96孔的通量足夠用;需要尋找要新藥靶點和疾病標記的實驗室可以考慮購買384孔板的儀器。假如經費有限無法購買384孔板儀器的實驗室，可以考慮購買運行速度快(帶有FAST模塊)的96孔板熒光定量PCR儀。有了高通量的儀器，你會發現樣品的制備和小體系、多樣本的PCR體系構建成為限制實驗速度和結果的頸瓶。Roche公司推出的MagnaPure核算純化系統可配合Roche的Lightcycyler熒光定量PCR儀使用。Eppendorf的epMotion5070、5075全自動工作站，即可解決核酸純化問題，又可進行96孔板、384孔板的PCR反應體系構建，不用加樣加到眼發黑、手抽筋。
2、硬件設計特點
熒光定量PCR儀主要有傳統的96孔板式、創新的離心式等，每種設計都有它的獨到之處但也都有無法避免的缺憾。
傳統的96孔板的熒光定量PCR可以容納的樣本量大，而且無需特殊的耗材。有些傳統的96孔板的儀器采用鹵鎢燈激發、CCD檢測，這些光學結構在96孔板的頂部，每個樣品孔距光源和檢測器的光程各不相同——邊緣效應，對結果產生影響。為了保證、準確的實驗結果，這類儀器在實驗過程中通常會使用ROX(一種熒光染料)或專用的Referencedye作為參照校正實驗結果。鹵鎢燈的使用壽命短、換成本較高已經成為很多用戶頭痛的問題。在實驗過程中鹵鎢燈作為一種熱光源，產生較多熱能對實驗結果有一定的影響。CCD大的優點就是可以同時掃描所有樣品中的熒光信號，但是靈敏度較低，而且同時檢測樣品間的熒光信號存在干擾。像ABI、Bio-rad 公司生產的熒光定量PCR就屬于這一種。但Bio-rad的IQ系列熒光定量PCR帶有梯度功能。創新的離心式的儀器通常選用LED激發、PMT檢測，離心式的設計上避免了邊緣效應。LED光源是冷光源對實驗沒有影響，因此無需采用其他熒光染料校正儀器，而且使用壽命長無需經常換。PMT每次只能收集單個熒光信號，但是檢測靈敏度高。但這類儀器運行速度非常快，但也存在樣本量小、耗材昂貴、沒有梯度功能、存在時間積分等缺點。Corbett的 Rotor-gene系列和Roche 的Lightcycler系列均為這一類儀器。
隨著熒光定量PCR技術的使用，聰明的儀器生產商紛紛在傳統的96孔板儀器上大作改進。先是 Stratagene的Mx3000p在檢測上突破了使用CCD改用PMT檢測熒光信號，大大提高了實驗的靈敏度，但激發光源仍然沿用傳統的鹵鎢燈并且沒有梯度功能。Eppendorf公司推出的Mastercycler eprealplex是一款帶有梯度功能的熒光定量PCR儀，使用了96個LED為激發光源，采用的CPM(第二代PMT)及96合一光纖為檢測系統，不但避免了邊緣效應還保證所有樣品間的熒光信號沒有干擾。
3、運行速度
在熒光定量PCR儀的眾多技術參數中，升降溫速度也是廠家喜歡大力宣傳的指標。快的升降溫，可以縮短反應進行的時間，而且縮短了可能的非特異性結合、反應的時間，提高PCR的特異性。為了好的完成實驗，各個廠家紛紛推出能快速運行的熒光定量PCR儀。例如 ROCHE推出的Lightcycler2.0利用空氣動力學原理，可在半小時左右完成30-40個循環。ABI的7500可以選配FAST模塊擁有 5°C/秒的升降溫速度，可在40分鐘左右完成30-40個循環。近eppendorf新推出的Mastercycler eprealplex4S和2S的銀質模塊熒光定量PCR儀，升降溫的速度可達到6℃/秒和4.5/秒，是目前同類產品中升降溫速度快的熒光定量PCR 儀。一個在其他儀器上原本需要40—60分鐘的PCR反應，eppendorf Mastercycler ep realplex4S和2S (銀質模塊)只需運行28分鐘——別小看這節約下來的幾十分鐘，一天下來就可以多運行好幾輪了。
4、靈活性
大規模繁忙的實驗室設備固然讓人羨慕，但是常規實驗室同樣可以有精彩的選擇。現在的儀器供應商擁有眾多技術，有的還能提供整個分子生物學的基礎研究平臺，不但了解、滿足您現在的需求，而且還考慮到了你可能變化的需求——升級和換模塊。Bio-rad的 Mycycler就可以選擇模塊升級為定量PCR儀。ABI的7900可以選擇將96孔槽變為384孔槽。像離心式的雙通道的Rotor- gene3000A就可以根據您研究的需要升級成四通道的熒光定量PCR儀。Eppendorf公司在這方面考慮的就加周全，如實驗室已經擁有 Mastercyclerep可以按照您的要求升級為Mastercycler eprealplex熒光定量PCR儀，而且可升級的型號有4種：2通道銀質、鋁制模塊和4通道銀質、鋁制模塊。您可以根據自己的經費和實驗需要購買、升級任何一款Mastercyclerep realplex熒光定量PCR儀。
