熒光定量PCR，是1996 年由美國Applied Biosystems 公司推出的一種新定量試驗(yàn)技術(shù)，它是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。

一、原理

PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；剛開始時, 探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上;PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步?；蛘呤褂脽晒馊玖?/span>SYBR。SYBR可以結(jié)合到雙鏈DNA上面，當(dāng)體系中的模板被擴(kuò)增時，SYBR可以有效結(jié)合到新合成的雙鏈上面，隨著PCR的進(jìn)行，結(jié)合的SYBR染料越來越多，被儀器檢測到的熒光信號越來越強(qiáng)，從而達(dá)到定量的目的。

二、應(yīng)用領(lǐng)域

臨床疾病診斷：各型肝炎、艾滋病、禽流感、結(jié)核、性病等傳染病診斷和療效評價；地中海貧血、血友病、性別發(fā)育異常、智力低下綜合癥、胎兒畸形等優(yōu)生優(yōu)育檢測；腫瘤標(biāo)志物及瘤基因檢測實(shí)現(xiàn)腫瘤病診斷；遺傳基因檢測實(shí)現(xiàn)遺傳病診斷。

動物疾病檢測：禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線桿菌、寄生蟲病等、炭疽芽孢桿菌。

食品安全：食源微生物、食品過敏源、轉(zhuǎn)基因、乳品企業(yè)阪崎腸桿菌等檢測。

科學(xué)研究：醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧、生物相關(guān)分子生物學(xué)定量研究。

應(yīng)用行業(yè)：各級各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)、大學(xué)及研究所、CDC、檢驗(yàn)檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。

三、熒光定量PCR前景展望

實(shí)時熒光定量PCR的出現(xiàn)，大地簡化了定量檢測的過程，而且真正實(shí)現(xiàn)了定量。多種檢測系統(tǒng)的出現(xiàn)，使實(shí)驗(yàn)的選擇性強(qiáng)。自動化操作提高了工作效率，反應(yīng)快速、重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果清晰。隨著生物芯片技術(shù)和熒光探針定量技術(shù)的結(jié)合，熒光定量PCR在醫(yī)學(xué)檢測及其他各個領(lǐng)域中的應(yīng)用前景將加廣闊，令人欣喜。盡管如此我們也應(yīng)清晰認(rèn)識到，FQ-PCR技術(shù)在我國各個研究領(lǐng)域的應(yīng)用并不多見，這就需要我國學(xué)者迎頭趕上，使FQ-PCR技術(shù)充分地推廣，以推動研究工作的快速發(fā)展。

四、熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)操作步驟

（一、）熒光定量PCR樣品RNA的抽提

①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。

②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。

③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。

④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀?；靹蚝螅?/span>4℃下7000rpm離心5分鐘。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。

（二）熒光定量PCRRNA質(zhì)量檢測

1）紫外吸收法測定

先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。

① 濃度測定

A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為：A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 μg/ml。具體計算如下：

RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495μl的TE中，測得A260 = 0.21

RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl

取5ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35 μl，剩余RNA總量為：

35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

②純度檢測

RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。

2）變性瓊脂糖凝膠電泳測定

①制膠

1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

10×MOPS電泳緩沖液

濃度 成分

0.4M MOPS，pH 7.0

0.1M 乙酸鈉

0.01M EDTA

灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。

②準(zhǔn)備RNA樣品

取3μgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

③電泳

上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2–3cm。

④紫外透射光下觀察并拍照

28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個小稍微擴(kuò)散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果。

（三、）熒光定量PCR樣品cDNA合成

①混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘。

③取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。

（四）熒光定量PCR樣品

管家基因（β-actin）實(shí)時定量PCR

①β-actin陽性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備 陽性模板的濃度為1011，反應(yīng)前取3μl按10倍稀釋（加水27μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。

②制備好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測樣本同時上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環(huán)。

（五）熒光定量PCR模板

①針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。

②PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。

③將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。

（六）熒光定量PCRPCR

①所有cDNA樣品分別配置實(shí)時定量 PCR反應(yīng)體系。

②將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：93℃2分鐘預(yù)變性，然后按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40個循環(huán)，后72℃7分鐘延伸。

   （七）熒光定量PCR引物列表

引物設(shè)計軟件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補(bǔ)；引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；引物不在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(。

（八）熒光定量PCR電泳

各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。

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