細胞乙醛脫氫酶2活性比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

細胞乙醛脫氫酶2活性比色法定量檢測試劑盒是一種旨在使用乙醛脫氫酶2敏感性抑制劑，通過檢測反應系統(tǒng)中氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）還原后峰值的增高，即采用比色法來測定細胞裂解萃取液樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術方法。該技術由大師級科學家精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞包括胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞等裂解懸液樣品（動物、人體等）乙醛脫氫酶2的特異活性檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術背景

乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase；ALDH；EC1.2.1.3），又稱為乙醛NAD氧化還原酶（aldehyde NAD－oxidoreductase）是一類NAD（P）依賴性酶，催化廣譜的外源性或內(nèi)源性脂肪族和芳香族乙醛類底物氧化，包括乙醇、氨基酸、生物胺（biogenic amine）、維生素、固醇類、脂質(zhì)、藥物和環(huán)境分子等代謝產(chǎn)物。乙醛脫氫酶是乙醇在體內(nèi)分解代謝過程中兩種主要酶之一。乙醛脫氫酶把乙醛中的兩個氫原子脫掉，使乙醛轉(zhuǎn)化為乙酸，生成的乙酸進入脂肪酸氧化途徑，終被氧化成二氧化碳和水。乙醛脫氫酶主要有兩種同工酶：ALDH₁和ALDH₂。ALDH₁存在于胞液中，ALDH₂存在于線粒體中，ALDH₂比ALDH₁的活性高。乙醛脫氫酶的缺少，使酒精不能被完全分解為水和二氧化碳，而是以乙醛繼續(xù)留在體內(nèi)，使人喝酒后產(chǎn)生惡心欲吐、昏迷不適等醉酒癥狀。基于來自于乙醇代謝產(chǎn)生的乙醛（acetaldehyde），在7-羥基-3-（4-羥苯基）-異黃酮-7-糖苷（Daidzein-7-O-β-D-glucopyranoside；Daidzin）存在與否的情況下，由乙醛脫氫酶2的催化作用，轉(zhuǎn)化為乙酸（acetic acid）產(chǎn)物后，通過測定反應體系中氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）轉(zhuǎn)化為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）的變化（340nm 波長），來定量分析乙醛脫氫酶2的特異活性。乙醛脫氫酶2反應系統(tǒng)為：

ALDH

CH₃OH  +  NAD⁺  +  H₂O  →  CH₃COOH  +  NADH  +  H⁺

 Daidzin

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A） 毫升

裂解液（Reagent B） 毫升

緩沖液（Reagent C） 毫升

反應液（Reagent D） 毫升

底物液（Reagent E）   毫升

陰性液（Reagent F）   毫升

專性液（Reagent G）   微升

產(chǎn)品說明書 1份

保存方式

保存緩沖液（Reagent C）、反應液（Reagent D）、底物液（Reagent E）和專性液（Reagent G）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反應液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細胞刮脫棒：用于脫離貼壁細胞

（微型）臺式離心機：用于樣品制備

比色皿或酶標板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標儀：用于比色分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的裂解液（Reagent B）置入冰槽里預冷。然后進行下列操作。

一、 樣品準備

1． 準備好25cm²細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 10⁶細胞）

2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細胞

6． 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）

7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉(zhuǎn)移到預冷的1.5毫升離心管

11． 強力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

1． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測定準備

1． 開啟并設定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長340nm，間隔60秒，讀數(shù)5次（共5分鐘），并置零 

2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底物液（Reagent E）避免光照；緩沖液（Reagent C）置于室溫下均衡溫度

三、 背景對照測定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反應液（Reagent D）

3． 加入xx微升底物液（Reagent E）

4． 在25℃溫度下孵育3分鐘

5． 加入xx微升陰性液（Reagent F）

6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

四、 樣品總活性測定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反應液（Reagent D）

3． 加入xx微升底物液（Reagent E）

4． 在25℃溫度下孵育3分鐘

5． 加入20微升待測樣品（或50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）

6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)） 

五、 樣品非特異活性測定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升專性液（Reagent G）

3． 加入20微升待測樣品（或50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在25℃溫度下孵育10分鐘

6． 加入xx微升緩沖液（Reagent C）

7． 加入xx微升反應液（Reagent D）

8． 加入xx微升底物液（Reagent E）

9． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

10． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)） 

六、計算樣品活性

1）樣品活性（總活性或非特異活性）

【（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量，毫升）X樣品稀釋倍數(shù)】÷【0.02（樣品容量，毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù) X 5（反應時間，分鐘）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾NAD/分鐘

2）樣品特異活性

樣品總活性測定－樣品非特異活性測定＝樣品特異活性

七、 酶標板測定

1. 背景對照和樣品總活性

1． 在96孔酶標板上做好相應標記：背景對照、樣品總活性

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中

3． 分別加入xx微升反應液（Reagent D）

4． 分別加入xx微升底物液（Reagent E）

5． 在25℃溫度下孵育3分鐘

6． 分別加入xx微升陰性液（Reagent F）或待測樣品（或10微克蛋白）到相應孔中（注意：樣品須清澈）

7． 輕輕搖動酶標板

8． 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)

2. 樣品非特異活性

1. 在96孔酶標板上做好相應標記：樣品非特異活性

2. 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中

3. 加入xx微升專性液（Reagent G）

4. 加入5微升待測樣品（或10微克蛋白）（注意：樣品須清澈）

5. 輕輕搖動96孔酶標板

6. 在25℃溫度下孵育10分鐘

7. 加入xx微升緩沖液（Reagent C）

8. 加入xx微升反應液（Reagent D）

9. 加入xx微升底物液（Reagent E）

10. 輕輕搖動酶標板

11. 即刻放進酶標儀檢測：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)

3. 計算樣品活性

1）樣品活性（總活性或非特異活性）

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.25（毫升，測定容量）]÷[0.005（樣品容量，毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.6（厘米）X 5（分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克 

單位＝微摩爾NAD/分鐘

2）樣品特異活性

樣品總活性測定－樣品非特異活性測定＝樣品特異活性

注意事項

1． 本產(chǎn)品為20次（比色皿；10個樣本）和80次（酶標板；40個樣本）操作，包括背景對照

2． 操作時，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次

4． 建議使用比色皿測定

5． 樣品須澄清，至關重要 

6． 加樣后3秒內(nèi)比色測定

7． 測定值由低到高變化；測定可持續(xù)5分鐘

8． 比色測定后，比色皿須清洗徹底

9． 樣本測定5分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

10． 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/20微升 （本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

11． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

12． 乙醛脫氫酶2單位活性定義為：在25℃，pH 8.0條件下，每分鐘內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化1微摩爾氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個活性單位

13． 本公司提供系列乙醇代謝酶類檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感