ELISA實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)以及常見問題解答

  酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)被稱為免疫測(cè)定金標(biāo)準(zhǔn)。是一種免疫學(xué)測(cè)定方法。ELISA是用于測(cè)定抗原抗體，根據(jù)樣本不同的類型和檢測(cè)方法來進(jìn)行相應(yīng)的制定。主要類型有雙抗體夾心法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法、雙抗原夾心法。

  雙抗體夾心法是常用的ELISA檢測(cè)類型，它是利用一個(gè)抗體進(jìn)行捕獲，另外一個(gè)抗體進(jìn)行檢測(cè)。雙抗體夾心法具有高特異性和高靈敏度，非常適用于復(fù)雜樣本，但夾心法通常檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，難度大于其他方法。

  一、雙抗夾心法實(shí)驗(yàn)步驟：

  二、雙抗夾心法實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)：

  1、樣品稀釋：

  (1)稀釋血清避免假陽(yáng)性的發(fā)生(把蛋白按照一定的倍數(shù)稀釋，如10倍、20倍，將抗原進(jìn)行稀釋包被反應(yīng);用稀釋好的陽(yáng)性參閱血清和陰性參閱血清進(jìn)行孵育后洗刷，加入酶結(jié)合物進(jìn)行反應(yīng)，孵育洗滌，加入底物顯色，停止反應(yīng)后分別測(cè)定O.D值，O.D值≥1.0的抗原稀釋度為適合的包被濃度。陰性參閱血清O.D值<0.1-0.2。這樣陽(yáng)性參閱血清和陰性參閱血清的O.D值就會(huì)有明顯差別)。

  (2)粉末型樣本需要短暫離心，如沾到管蓋、管壁需要將標(biāo)準(zhǔn)品沉入管底;加入蒸餾水時(shí)需短暫輕柔渦旋，靜置10-30min，充分溶解。

  (3)加水后等待充分溶解后可選擇吸吹或渦旋混勻。

  2、試劑平衡：

  (1)所有的試劑和樣本需平衡至室溫5-10min，避免產(chǎn)生動(dòng)力學(xué)反應(yīng)差異這會(huì)影響準(zhǔn)確性。

  3、混勻：

  (1)稀釋前、后的樣品需進(jìn)行搖床充分混勻。

  4、加樣操作：

  (1)定期校準(zhǔn)移液搶。

  (2)加樣前需混勻，避免加入到孔壁上，盡可能避免氣泡產(chǎn)生。

  (3)避免樣本濺出(可用吸水紙吸取濺出液體)。

  (4)避免加樣槍頭反復(fù)吸取導(dǎo)致樣本污染。

  (5)加樣操作按照說明書的順序來進(jìn)行，確保顯色時(shí)間一致。

  5、孵育：

  (1)震蕩孵育，加快抗原抗體之間的相互接觸，使反應(yīng)加充分。

  (2)水浴溫度保持37℃。

  (3)水浴需要封閉防止污染。

  6、洗板：

  (1)洗液盡量不要溢出孔外。

  (2)拍過酶標(biāo)記物后及時(shí)換吸水紙，避免影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

  (3)手工洗板時(shí)拍板要垂直且用力不能過猛，可避免交叉污染。

  (4)扣干后的酶標(biāo)板應(yīng)快速加液，避免干板太久。

  (5)采用全自動(dòng)時(shí)需檢查各項(xiàng)水瓶是否充足。

  (6)采用全自動(dòng)時(shí)檢查是否堵塞。

  7、顯色：

  (1)顯色需控制好時(shí)間(根據(jù)說明書操作),時(shí)間過短,結(jié)果偏低;時(shí)間過長(zhǎng),空白增高/非特異性顯色增加。

  (2)顯色呈梯度。

  8、比色：

  (1)跟換濾光片時(shí)注意錯(cuò)用的可能性。

  9、檢測(cè)：

  (1)酶標(biāo)儀使用前預(yù)熱10-15min，結(jié)果穩(wěn)定。

  (2)雙波長(zhǎng)測(cè)定吸光值，可以減少指紋、雜質(zhì)等帶來的誤差(檢測(cè)波長(zhǎng)450nm-參考波長(zhǎng)630nm(570nm))。

  二、試劑盒選擇注意事項(xiàng)：

  1、選擇明確：

  (1)樣本種屬類型

  (2)樣本類型：

  2、樣品中檢測(cè)物水平選擇：

  (1)寬動(dòng)力學(xué)檢測(cè)范圍：對(duì)樣品種待測(cè)物水平?jīng)]有任何參考數(shù)據(jù)。

  (2)高靈敏度試劑：待檢物含量很低。

  3、樣品獲得性選擇：

  (1)通常試劑盒的樣品用量在40μL或100μL，少部分用量20μL左右。

  4、試劑盒技術(shù)參數(shù)選擇：

  (1)回收率達(dá)到80-120%之間。

  (2)按照標(biāo)準(zhǔn)示值誤差：100μg。

  (3)誤差系數(shù)<5%-8%。

  (4)建議優(yōu)先考慮雙單抗。

  (5)操作方便

  三、常見問題解答：

  1、樣本的處理、收集和保存問題：

  (1)細(xì)胞培養(yǎng)上清通過離心收集，分裝保存，溫度-20℃。

  (2)血清樣本分離管分離血清，樣本凝集30min后離心，吸取血清立即檢測(cè)，分裝保存，溫度-20℃。

  (3)血漿樣本采用EDTA收集樣本，需在30min內(nèi)離心，吸取樣本立即檢測(cè)，分裝保存，溫度-20℃。

  (4)避免選擇嚴(yán)重溶血或高血脂樣本，收集后快速檢測(cè)并儲(chǔ)存，若未能在24h內(nèi)檢測(cè)，可暫時(shí)存放2-8℃。

  (5)分析前樣本需緩慢恢復(fù)至室溫，注意是否有沉淀物需祛除干凈。

  2、樣本反復(fù)凍融，具有哪些影響：

  (1)蛋白易降解。

  (2)細(xì)胞上清凍融1-2次后，蛋白降解嚴(yán)重。

  3、陰性對(duì)照和空白對(duì)照的區(qū)別：

  (1)空白對(duì)照：稀釋液代替樣本，檢測(cè)顯色本地，讀取陽(yáng)性、陰性、樣本孔的吸光值。

  (2)陰性對(duì)照：樣本與待檢測(cè)物具有同源、同質(zhì)性，但不含有待檢測(cè)物質(zhì)，可鑒別處理因素之間的差異性。

  4、添加顯色后，無色或陽(yáng)性對(duì)照弱：

  (1)試劑盒需采用同批次。

  (2)注意稀釋倍數(shù)是否正確。

  (3)酶結(jié)合物是否未添加。

  (4)試劑是否添加錯(cuò)誤。

  (5)顯色液是否變質(zhì)。

  (6)確認(rèn)各項(xiàng)容器干凈無污染。

  (7)注意配置時(shí)看清標(biāo)簽和說明書。

  (8)觀察液面高度是否一致，避免試劑漏加。

  5、樣本濃度不正確：

  (1)標(biāo)曲是否適合，有無失效等。

  (2)樣本含量或靈敏度較低無法被檢測(cè)到，濃縮樣本。

  (3)樣本含量或靈敏度較高，超過標(biāo)曲濃度需稀釋樣本。

  6、為什么吸光值過高：

  (1)若如值正確，則顯色過高。

  (2)波長(zhǎng)選擇錯(cuò)誤，可選擇雙波長(zhǎng)檢測(cè)。

  7、為什么吸光值低：

  (1)樣本未充分溶解，(混勻后需靜置30min)。

  (2)樣本反復(fù)凍融，活性減弱。

  (3)孵育的溫度和時(shí)間為滿足要求(按照說明書操作)。

  8、無梯度：

  (1)樣本污染，需要跟換樣本。

  (2)稀釋倍數(shù)錯(cuò)誤，重新做。

  (3)抗體濃度高，換抗體或稀釋。

  (4)底物孵育是否時(shí)間和溫度過短。

  (5)孵育需封蓋。

  實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯總事項(xiàng)：

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