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古朵分享：ELISA實驗注意事項以及常見問題解答
發布時間：2023-11-22瀏覽次數：815返回列表
ELISA實驗注意事項以及常見問題解答
酶聯免疫吸附測定(ELISA)被稱為免疫測定金標準。是一種免疫學測定方法。ELISA是用于測定抗原抗體，根據樣本不同的類型和檢測方法來進行相應的制定。主要類型有雙抗體夾心法、間接法、競爭法、雙抗原夾心法。
雙抗體夾心法是常用的ELISA檢測類型，它是利用一個抗體進行捕獲，另外一個抗體進行檢測。雙抗體夾心法具有高特異性和高靈敏度，非常適用于復雜樣本，但夾心法通常檢測時間較長，難度大于其他方法。
一、雙抗夾心法實驗步驟：
二、雙抗夾心法實驗操作注意事項：
1、樣品稀釋：
(1)稀釋血清避免假陽性的發生(把蛋白按照一定的倍數稀釋，如10倍、20倍，將抗原進行稀釋包被反應;用稀釋好的陽性參閱血清和陰性參閱血清進行孵育后洗刷，加入酶結合物進行反應，孵育洗滌，加入底物顯色，停止反應后分別測定O.D值，O.D值≥1.0的抗原稀釋度為適合的包被濃度。陰性參閱血清O.D值<0.1-0.2。這樣陽性參閱血清和陰性參閱血清的O.D值就會有明顯差別)。
(2)粉末型樣本需要短暫離心，如沾到管蓋、管壁需要將標準品沉入管底;加入蒸餾水時需短暫輕柔渦旋，靜置10-30min，充分溶解。
(3)加水后等待充分溶解后可選擇吸吹或渦旋混勻。
2、試劑平衡：
(1)所有的試劑和樣本需平衡至室溫5-10min，避免產生動力學反應差異這會影響準確性。
3、混勻：
(1)稀釋前、后的樣品需進行搖床充分混勻。
4、加樣操作：
(1)定期校準移液搶。
(2)加樣前需混勻，避免加入到孔壁上，盡可能避免氣泡產生。
(3)避免樣本濺出(可用吸水紙吸取濺出液體)。
(4)避免加樣槍頭反復吸取導致樣本污染。
(5)加樣操作按照說明書的順序來進行，確保顯色時間一致。
5、孵育：
(1)震蕩孵育，加快抗原抗體之間的相互接觸，使反應加充分。
(2)水浴溫度保持37℃。
(3)水浴需要封閉防止污染。
6、洗板：
(1)洗液盡量不要溢出孔外。
(2)拍過酶標記物后及時換吸水紙，避免影響實驗的準確性。
(3)手工洗板時拍板要垂直且用力不能過猛，可避免交叉污染。
(4)扣干后的酶標板應快速加液，避免干板太久。
(5)采用全自動時需檢查各項水瓶是否充足。
(6)采用全自動時檢查是否堵塞。
7、顯色：
(1)顯色需控制好時間(根據說明書操作),時間過短,結果偏低;時間過長,空白增高/非特異性顯色增加。
(2)顯色呈梯度。
8、比色：
(1)跟換濾光片時注意錯用的可能性。
9、檢測：
(1)酶標儀使用前預熱10-15min，結果穩定。
(2)雙波長測定吸光值，可以減少指紋、雜質等帶來的誤差(檢測波長450nm-參考波長630nm(570nm))。
二、試劑盒選擇注意事項：
1、選擇明確：
(1)樣本種屬類型
(2)樣本類型：
2、樣品中檢測物水平選擇：
(1)寬動力學檢測范圍：對樣品種待測物水平沒有任何參考數據。
(2)高靈敏度試劑：待檢物含量很低。
3、樣品獲得性選擇：
(1)通常試劑盒的樣品用量在40μL或100μL，少部分用量20μL左右。
4、試劑盒技術參數選擇：
(1)回收率達到80-120%之間。
(2)按照標準示值誤差：100μg。
(3)誤差系數<5%-8%。
(4)建議優先考慮雙單抗。
(5)操作方便
三、常見問題解答：
1、樣本的處理、收集和保存問題：
(1)細胞培養上清通過離心收集，分裝保存，溫度-20℃。
(2)血清樣本分離管分離血清，樣本凝集30min后離心，吸取血清立即檢測，分裝保存，溫度-20℃。
(3)血漿樣本采用EDTA收集樣本，需在30min內離心，吸取樣本立即檢測，分裝保存，溫度-20℃。
(4)避免選擇嚴重溶血或高血脂樣本，收集后快速檢測并儲存，若未能在24h內檢測，可暫時存放2-8℃。
(5)分析前樣本需緩慢恢復至室溫，注意是否有沉淀物需祛除干凈。
2、樣本反復凍融，具有哪些影響：
(1)蛋白易降解。
(2)細胞上清凍融1-2次后，蛋白降解嚴重。
3、陰性對照和空白對照的區別：
(1)空白對照：稀釋液代替樣本，檢測顯色本地，讀取陽性、陰性、樣本孔的吸光值。
(2)陰性對照：樣本與待檢測物具有同源、同質性，但不含有待檢測物質，可鑒別處理因素之間的差異性。
4、添加顯色后，無色或陽性對照弱：
(1)試劑盒需采用同批次。
(2)注意稀釋倍數是否正確。
(3)酶結合物是否未添加。
(4)試劑是否添加錯誤。
(5)顯色液是否變質。
(6)確認各項容器干凈無污染。
(7)注意配置時看清標簽和說明書。
(8)觀察液面高度是否一致，避免試劑漏加。
5、樣本濃度不正確：
(1)標曲是否適合，有無失效等。
(2)樣本含量或靈敏度較低無法被檢測到，濃縮樣本。
(3)樣本含量或靈敏度較高，超過標曲濃度需稀釋樣本。
6、為什么吸光值過高：
(1)若如值正確，則顯色過高。
(2)波長選擇錯誤，可選擇雙波長檢測。
7、為什么吸光值低：
(1)樣本未充分溶解，(混勻后需靜置30min)。
(2)樣本反復凍融，活性減弱。
(3)孵育的溫度和時間為滿足要求(按照說明書操作)。
8、無梯度：
(1)樣本污染，需要跟換樣本。
(2)稀釋倍數錯誤，重新做。
(3)抗體濃度高，換抗體或稀釋。
(4)底物孵育是否時間和溫度過短。
(5)孵育需封蓋。
實驗結果匯總事項：
ELISA試劑盒 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區。是一家專門從事生物技術相關產品，勵志研發和銷售的綜合性生物公司，產品遠銷多個國家和地區，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發高質量的新產品，提供客戶滿意的綜合服務質量"的方針。古朵試劑盒
標簽：ELISA 試劑盒 古朵生物 酶聯免疫試劑盒 抗體 抗原 標準品 稀釋液
