干貨分享：抗體的制備方法與原理

  一、抗血清的制備

  有了質量好的抗原，還必須選擇適當的免疫途徑，才能產生質量好(特異性強和效價高)的抗體。

  (一)用于免疫的動物

  作免疫用的動物有哺乳類和禽類，主要為羊、馬、家兔、猴、豬、豚鼠、雞等，實驗室常用者為家兔、山羊和豚鼠等。動物種類的選擇主要根據抗原的生物學特性和所要獲得抗血清數量，如一般制備抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因動物反應良好，而且能夠提供足夠數量的血清，用于免疫的動物應適齡，健壯，無感染性疾患，好為///雄性，此外還需十分注意動物的飼養，以消除動物的個體差異以及在免疫過程中死亡的影響。若用兔，好用純種新西蘭兔，一組三只，兔的體重以2～3kg為宜。

  (二)免疫途徑

  免疫途徑有多種多樣，如靜脈內、腹腔內、肌肉內、皮內、皮下、淋巴結內注射等，一般常用皮下或背部多點皮內注射，每點注射0.1ml左右。途徑的選擇決定于抗原的生物學特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物學活性抗原，一般不宜采用靜脈注射。

  (三)佐劑

  由于不同個體對同一抗原的反應性不同，而且不同抗原產生免疫反應的能力也有強有弱，因此常常在注射抗原的同時，加入能增強抗原的抗原性物質，以刺激機體產生較強的免疫反應，這種物質稱為免疫佐劑。

  佐劑除了延長抗原在體內的存留時間，增加抗原刺激作用外，主要的是，它能刺激網狀內皮系統，使參與免疫反應的免疫活性細胞增多，促進T細胞與B細胞的相互作用，從而增強機體對抗原的細胞免疫和抗體的產生。

  常用的佐劑是福氏佐劑(Freund adjuvant),其成分通常是羊毛脂1份、石臘油5份，羊毛脂與石臘油的比例，視需要可調整為1：2～9(V/V)，這是不完全福氏佐劑，在每毫升不完全佐劑加入1～20mg卡介苗就成為完全佐劑。

  配制方法：按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內，用超聲波使之混勻，高壓滅菌，置4℃下保存備用。免疫前取等容積完全或不完全佐劑與免疫原溶液混合，用振蕩器混勻成乳狀，也可以在免疫前取需要量佐劑置乳缽中研磨，均勻后再邊磨邊滴加入等容積抗原液(其中加卡介苗3～4mg/ml或不加)，加完后再繼續研磨成乳劑，滴于冰水上5～10min內完全不擴散為止。為避免損失抗原，亦可用一注射器裝抗原液，另一注射器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管連接，然后二者來回反復抽吸，約數十分鐘后即能完全乳化。檢查合格后即以其中一注射器作注射用。

  (四)免疫方法

  抗原劑量，首次劑量為300～500μg，加強免疫的劑量約為首次劑量為1/4左右。每2～3周加強免疫一次。加強免疫時用不完全佐劑，首次免疫時皮下注射百日*疫苗0.5ml，加強免疫時不必注射百日*疫苗。

  在第2次加強免疫后2周，從耳緣靜脈取2～3ml血，制備血清，檢測抗體效價(見后)。如未達到預期效價，需再進行加強免疫，直到滿意時為止(圖2-3)。當抗體效價達到預期水平時，即可放血制備抗血清。

  圖2-3 抗體反應

  (五)抗血清的采集與保存

  家兔是常用以產生抗體的動物，因此這里主要討論兔血的收集。羊等較大動物以頸靜脈、動脈取血，鼠等小動物取血可參閱有關資料。取兔血有兩種方法，一是耳緣靜脈或耳動脈放血，一是頸動脈入血，也可心臟采血。取動脈或靜脈放血時，將兔放入一個特造的木匣或籠內，耳露于箱(籠)外，也可由另一人捉住兔身。剪去耳緣的毛，用少許二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管擴張、充血。用手輕拉耳尖，以單面剃須刀或尖的手術刀片，快速切開動脈或靜脈，血液即流出，每次可收集30～40ml 。然后用棉球壓迫止血，凝血后洗去二甲苯。二星期后，可在另一耳放血。此法可反復多次放血。頸動脈放血時，將兔仰臥，固定于兔臺，剪去頸部的毛，切開皮膚，暴露頸動脈，插管，放血。放血過程中要嚴格按無菌要求進行。

  收集的血液置于室溫下1h左右，凝固后，置4℃下，過夜(切勿冰凍)析出血清，離心，4000rpm,10min。在無菌條件，吸出血清，分裝(0.05～0.2ml)，貯于-40℃以下冰箱，或凍干后貯存于4。C冰箱保存。

  (六)抗血清質量的評價

  在免疫期間，不僅各個不同的動物，而且同一動物在不同的時間內抗血清效價、特異性、親合力等都可能發生變化，因而必須經常地采血測試。只有在對抗血清的效價、特異性、親合力等方面作徹底的評價后，才可使用所取得的抗血清。

  1.效價  抗血清的效價，就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價測定的方法常用的是放射免疫法，此法對所有的抗體均適用。某些由大分子(如蛋白類)抗原所產生的抗體，可用雙擴散等方法測定。前者測定的效價極為。而后者則粗糙得多。

  (1)放射免疫法： 以不同稀釋度的抗血清與優質標記抗原混合，孵育24h后，測定其結合率。通常以結合率為50%的血清稀度和為效價。如某抗血清的結合率為50%時的稀釋度為1：15000，則該血清的效價就是1：15000。抗血清的效價，除由抗血清本身的性質決定外，還受標記抗原的質量、孵育時間，所用稀釋液的成分及其pH等因素的影響，在工作中必須引起注意。(測定方法見第8章 )

  (2)雙向擴散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴散，兩者在相交處產生沉淀線，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。

  球脂板的制備：100ml pH7.1 的磷酸鹽緩沖液加到15g的瓊脂內，于水浴中加溫，攪拌，使瓊脂完全溶解，趁熱用紗布過濾，待溶液冷卻到65℃左右時，加入疊氮鈉(NaN3)，使其在溶液中的濃度為0.1%。用移液管把瓊脂放在干凈平皿或玻片上，約3mm厚，待其冷卻，完全凝固后，用打孔器打孔(圖2-4)。中央孔內加適量抗原(容量為50μl)，周圍各孔內分別加入50μl 1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀釋的抗血清，37℃下孵育24h，觀察有無沉淀線產生，以判斷血清的稀釋度(圖2-5)。

  2.特異性測定

  抗血清的特異性或稱專一性是指抗血清對相應的抗原及近似的抗原物質的識別能力。特異性好就是抗血清的識別能力強。通常，特異性是以交叉反應率來表示的。交叉反應率低，表示抗血清的特異性好，反之則特異性差。交叉反應率一般是用競爭抑制曲線來判斷的。以不同濃度的抗原和近似抗原物質分別做競爭抑制曲線，計算各自的結合率(B/T或B/B0)，求出各自在IC50時的濃度，按下列公式計算交叉反應率。

  S=y/Z×

  S：交叉反應率，y：IC50時抗原濃度，Z：IC50時近似抗原物質的濃度。

  如某抗原的IC50濃度為90Pg/管，而一些近似抗原物質IC50濃度幾乎是無限大，可以說這一抗血清與其它抗原物質的交叉反應率近似零，即無交叉反應，該抗血清的特異性是好的。

  3.親合力   在免疫學中， 親合力是指抗體與結合抗原體的活度或牢固度。抗體與抗原結合疏松，結合后會迅速解離，稱為親合力低，反之，親合力高。親合力的高低是由抗原分子的大小，抗體分子的結合位點與抗原的決定基之間的立體結構型的合適程度決定的。親合力常以親合常數K表示。K的單位是升/摩爾(L/mol)。在RIA中，K是該抗血清能達到的小檢出量(靈敏度)的倒數，K=1/[H]，[H]是小檢出量，通常，K的范圍在108～1012L/mol之間，也有高達1014L/mol的。

  計算親合常數的方法20余種，計算出的K都不能真實反映實驗情況，只能作為參考。

  (七)免疫失敗的可能原因及應采取的措施

  有時不能獲得滿意的抗血清，可從下列幾方面找原因，并改進之。

  (1)免疫動物的種屬及品系是否合適，可考慮改變動物的種屬或品系，或擴大免疫動物的數量。

  (2)抗原質量是否良好，可改用其它廠家的產品或改用同一廠家的其它批號，也可考慮改變抗原分子的部分結構，或改進提取方法。

  (3)制備的免疫原是否符合要求，可從偶聯劑，載體、抗原或載體的比例、反應時間等多方面去考慮，并加以改進。

  (4)所用的佐劑是否合適，乳化是否完全，可改用其它佐劑，或加強乳化。

  (5)免疫的方法、劑量，加強免疫的間隔時間和次數，免疫的途徑是否合適。

  (6)動物的飼養是否得當，如營養(飼料、飲水)、環境衛生(通風、采光、溫度)是否符合要求，動物的健康情況是否良好等。

  二、單克隆抗體的制備

  1975年Kohler和Milstein發現將小鼠骨髓瘤細胞與和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合，形成的雜交瘤細胞既可產生抗體，又可無性繁殖，從而創立了單克隆抗體雜交瘤技術。這一技術上的突破使血清學的研究進入了一個高度的新紀元。

  免疫細胞化學的 技術關鍵之一是制備特異性強、親合力大、滴度高的特異性抗體，由于每種抗原都有幾個抗原決定簇，用它免疫動物將產生對各個決定簇的抗體，即多克隆抗體。單克隆抗體則是由一個產生抗體的細胞與一個骨髓瘤細胞融合而形成的雜交廇細胞經無性繁殖而來的細胞群所產生的，所以它的免疫球蛋白屬同一類型，質地純一，而且它是針對某一抗原決定簇的，因此特異性強，親合性也一致。單克隆抗體(McAb)的特性和常規血清抗體的特性比較見2-3。

  表2—3 單克隆抗體(McAb)和常規免疫血清抗體的特性比較

  項目常規免疫血清抗體McAb

  抗體產生細胞多克隆性單克隆性

  抗體的結合力特異性識別多種抗原決定簇特異性識別單一抗原決定簇

  免疫球蛋白類別及亞類不均一性，質地混雜同一類屬，質地純一

  特異性與親合力批與批之間不同特異性高，抗體均一

  有效抗體含量0.01～0.1mg/ml(小鼠腹水)0.5～5.0mg/ml(小鼠腹水)

  0.5～10.0μg/ml(培養物上清液)

  用于常規免疫學實驗可用單抗組合應用

  抗原抗體形成格子結構(沉淀反應)容易形成一般難形成

  抗原抗體反應抗體混雜，形成2分子反應困難，不可逆可形成2分子反應，可逆

  單克隆抗體的制備方法如下。

  (一)動物的選擇與免疫

  1.動物的選擇  純種BALB/C小鼠，較溫順，離窩的活動范圍小，體弱，食量及排污較小，一般環境潔凈的實驗室均能飼養成活。目前開展雜交瘤技術的實驗室多選用純種BALA/C小鼠。

  2.免疫方案   選擇合適的免疫方案對于細胞融合雜交的成功，獲得高質量的McAb至關重要。一般在融合前兩個月左右根據確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應根據抗原的特性不同而定。

  (1)可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應先制備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑。

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