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大鼠神經生長因子（NGF）ELISA 檢測試劑盒說明書
發布時間：2023-10-26瀏覽次數：966返回列表
本試劑僅供研究使用 標本：血清或血漿
試驗原理：
NGF試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）.已知NGF濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將NGF和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然后加入底物A、B，和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中NGF的濃度呈比例關系。
試劑盒內容及其配制
|
試劑盒成份（2-8℃保存） |
96孔配置 |
48孔配置 |
配制 |
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96/48人份酶標板 |
1塊板（96T） |
半塊板（48T） |
即用型 |
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塑料膜板蓋 |
1塊 |
半塊 |
即用型 |
|
標準品：80ng/ml |
1瓶（0.6ml） |
1瓶（0.3ml） |
按說明書進行稀稀 |
|
空白對照 |
1瓶（1.0ml） |
1瓶（0.5ml） |
即用型 |
|
標準品稀釋緩沖液 |
1瓶（5ml） |
1瓶（2.5ml） |
即用型 |
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生物素標記的抗NGF抗體 |
1瓶（6ml） |
1瓶（3.0ml） |
即用型 |
|
親和鏈酶素-HRP |
1瓶（10ml） |
1瓶（5.0ml） |
即用型 |
|
洗滌緩沖液 |
1瓶（20ml） |
1瓶（10ml） |
按說明書進行稀釋 |
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底物A |
1瓶（6.0ml） |
1瓶（3.0ml） |
即用型 |
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底物B |
1瓶（6.0ml） |
1瓶（3.0ml） |
即用型 |
|
終止液 |
1瓶（6.0ml） |
1瓶（3.0ml） |
即用型 |
|
標本稀釋液 |
1瓶（12ml） |
1瓶（6.0ml） |
即用型 |
自備材料
1． 蒸餾水。
2． 加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
3． 振蕩器及磁力攪拌器等。
安全性
1． 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。
2． 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3． 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。
操作注意事項
1． 試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。
2． 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。
3． 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
4． 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
5． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6． 洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
7． 底物A應揮發，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
8． 加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
9． 按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。
樣品收集、處理及保存方法
1、 血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2、 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
3、 細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4、 組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液
5、 保存------如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
試劑的準備
1． 標準品：標準品的系列稀釋應在實驗時準備，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：
|
80 ng/ml |
（6號標準品） |
原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。 |
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40 ng/ml |
（5號標準品） |
100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液 |
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20 ng/ml |
（4號標準品） |
100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液 |
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10 ng/ml |
（3號標準品） |
100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液 |
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5.0 ng/ml |
（2號標準品） |
100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液 |
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2.5 ng/ml |
（1號標準品） |
100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液 |
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0 ng/ml |
（空白對照） |
原始濃度不用稀釋直接加入50ul。 |
2． 洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。
操作步驟
1． 使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產生加樣上的誤差。
2． 根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用復孔的盡量做復孔。標本用標本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應孔內。
3． 加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。
4． 甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
5． 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6． 甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
7． 每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。
8． 取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結果。
9． 在450nm波長處測定各孔的OD值。
建議使用的實驗方案
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標準品濃度（ng/ml） |
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||||||||||
|
A |
80 |
80 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
|
B |
40 |
40 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
|
C |
20 |
20 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
|
D |
10 |
10 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
|
E |
5.0 |
5.0 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
|
F |
2.5 |
2.5 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
|
G |
0 |
0 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
|
H |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
樣品 |
局限
6號標準品以上的結果為非線性的，根據此標準曲線無法得到的結果。
試劑盒性能
1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。
2. 特異性：不與其它細胞因子反應。
3. 重復性：板內、板間變異系數均小于10%。
結果 判 斷 與 分 析
1、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應的NGF標準品濃度為橫坐標（X），做得相應的曲線，樣品的NGF含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。
3、檢測值范圍：0-80ng/ml
4、敏感度： 0.1 ng/ml
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