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技術(shù)原理:免疫熒光染色原理及步驟
發(fā)布時間:2023-09-05瀏覽次數(shù):969返回列表
技術(shù)原理:免疫熒光染色原理及步驟
免疫熒光又稱免疫熒光抗體。免疫熒光實驗原理是將熒光素標記在相應的抗體上,直接與相應抗原反應。其優(yōu)點是方法簡便、特異性高,非特異性熒光染色少,相對使用標記抗體用量偏大。利用抗原抗體反應進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。
下面古朵生物詳細介紹免疫熒光染色步驟:
1. 滴加 0.01mol/L,pH7.4 的PBS于待檢標本片上,10min后棄去,使標本保持一定濕度。
2. 滴加適當稀釋的熒光標記的抗體溶液,使其覆蓋標本,置于有蓋搪瓷盒內(nèi),保溫一定時間(參考:30min)。
3. 取出玻片,置玻片架上,先用 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 沖洗后,再按順序過 0.01mol/L,pH7.4 的 PBS 三缸浸泡,每缸 3-5 min,不時振蕩。
4. 取出玻片,用濾紙吸去多余水分,但不使標本干燥,加一滴緩沖甘油,以蓋玻片覆蓋。
5. 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標本的特異性熒光強度,一般可用“+"表示:(-)無熒光;(±)極弱的可疑熒光;(+)熒光較弱,但清楚可見;(++)熒光明亮;(+++--++++)熒光閃亮。待檢標本特異性熒光染色強度達“++"以上,而各種對照顯示為(±)或(-),即可判定為陽性。
免疫熒光實驗操作步驟:
一、細胞準備:
對單層生長細胞,在傳代培養(yǎng)時,將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,待細胞接近長成單層后取出蓋玻片,PBS洗兩次;對懸浮生長細胞,取對數(shù)生長細胞,用PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次,用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。
二、固定和透化
1. 在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的蓋玻片用1 × PBS浸洗3次,每次3 min。
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15 min,1 × PBS浸洗玻片3次,每次3 min。
3. 0.5% Triton X-100(1× PBS配制 )室溫通透細胞15 min(細胞膜上表達的抗原省略此步驟), 1 × PBS浸洗玻片3次,每次3min。
三、封閉
4. 吸水紙吸干1 ×PBS,在玻片上滴加5%的正常血清(與二抗種屬來源一致或相似),室溫封閉1 h。
四、抗體孵育
5. 吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒,4 ℃孵育過夜。
6. 加熒光二抗: PBST 浸洗爬片3次,每次3 min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中37℃孵育1 h,PBST浸洗爬片3次,每次3 min。
注意:從加熒光二抗起,后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行。
五、固定拍照
7. 復染核:滴加DAPI避光孵育5 min,對標本進行染核,PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI。
8. 用吸水紙吸干爬片上的液體,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。
免疫熒光染色 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品,勵志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司,產(chǎn)品遠銷多個國家和地區(qū),我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向,不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品,提供客戶滿意的綜合服務質(zhì)量"的方針。








