β-半乳糖苷酶(β-GAL)活性檢測試劑盒技術(shù)說明書

  產(chǎn)品規(guī)格：50管/24樣

  產(chǎn)品內(nèi)容：

  溶液的配制：

  1. 試劑一：臨用前每瓶加入5mL雙蒸水，充分溶解備用;用不完的試劑仍-20℃保存。

  2. 標(biāo)準(zhǔn)品：5μmol/mL的對硝基苯f溶液。

  產(chǎn)品說明：

  β-GAL(EC 3.2.1.23)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，能夠催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷鍵水解，此外還具有轉(zhuǎn)半乳糖苷的作用。β-GAL不僅可為植物的快速生長釋放儲存的能量，還能在正常的多糖代謝、細(xì)胞壁組分代謝以及衰老時細(xì)胞壁降解過程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖殘基的水解，釋放自由的半乳糖。

  β-GAL分解對-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成對-硝基苯f，后者在400nm有大吸收峰，通過測定吸光值升高速率來計算β-GAL活性。

  注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者 增加樣本量進(jìn)行檢測。

  需自備的儀器和用品：

  可見分光光度計、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

  操作步驟：

  一、樣本處理(可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn))

  1. 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個)：提取液體積(mL)為500~1000：1的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液)，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴，功率20%或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次);15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

  2. 組織：按照組織質(zhì)量(g)：提取液體積(mL)為1：5~10的比例(建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液)，進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

  二、測定步驟：

  1. 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至400nm，蒸餾水調(diào)零。

  2. 標(biāo)準(zhǔn)液的處理：用蒸餾水將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL。

  3. 樣本測定(在EP管中依次加入下列試劑)：

  三、β-GAL活性計算：

  1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：

  根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度(x，減去濃度為0的標(biāo)準(zhǔn)管OD值)和濃度(y，nmol/ml)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線， 將△A帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計算樣品生成的產(chǎn)物量(nmol/ml)。

  2. β-GAL活性計算：

  (1)按樣本蛋白濃度計算：

  單位的定義：每mg組織蛋白每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯f定義為一個酶活力單位。

  β-GAL活力(nmol/h /mg prot)=(y×V反總)÷(V樣×Cpr)÷T

  =20×y÷Cpr

  蛋白濃度需要另外測定。

  (2)按樣本鮮重計算：

  單位的定義：每g組織每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯f定義為一個酶活力單位。

  β-GAL活力(nmol/h /g鮮重)=(y×V反總)÷(W×V樣÷V樣總)÷T

  =20×y ÷W

  (3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

  單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯f定義為一個酶活力單位。

  β-GAL活力(nmol/h /104 cell)= (y×V反總)÷(500×V樣÷V樣總)÷T

  =0.04×y

  Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL;V反總：反應(yīng)體系總體積，0.5mL;V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05mL;V樣總：加入提取液體積，1mL;W：樣本質(zhì)量，g;500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬;T：反應(yīng)時間，0.5h。

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