實時熒光定量PCR（Real time PCR）是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實現(xiàn)了實時監(jiān)測整個PCR進程，并對起始模板進行定量分析的方法。其涉及領(lǐng)域包括：臨床疾病診斷、動物檢驗檢疫、食品安全和科學(xué)研究等。在xin型guan狀病毒、肝炎、艾zi病、流感、登革熱、感染性腹瀉等的檢測、診斷和治療上發(fā)揮著重要作用。

實時熒光定量PCR法可分別為SYBR Green l熒光染料法和Taqman探針法。日常進行核酸檢測就是運用Taqman探針法，新guan病毒核酸檢測也是利用此項技術(shù)。該法高度特異，其核心是利用Taq酶的3’→5’外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號。

在Taqman探針法的定量PCR反應(yīng)體系中，包括一對PCR引物和一條探針。探針的5’端標(biāo)記有報告基團（Reporter，R），如FAM、VIC等，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團（Quencher，Q），如TAMRA等。當(dāng)探針完整時，報告基團所發(fā)射的熒光被淬滅基團吸收，儀器不能檢測信號。隨著PCR反應(yīng)的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其3’→5’外切核酸酶活性被探針切斷，報告基團遠離淬滅基團，能量不能被吸收，就產(chǎn)生熒光信號。因此每經(jīng)過一個循環(huán)，熒光信號就和目的片段一樣有一個同步指數(shù)增長過程。

這里涉及基線和CT值的概念。基線是用來確定背景的熒光信號強度的參比對照，相當(dāng)于PCR指數(shù)擴增期以前的熒光強度水平。CT值是PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，其由擴增反應(yīng)體系中模板的初始濃度決定。

與傳統(tǒng)PCR相比，實時熒光定量PCR有著以下優(yōu)點：

1．檢測結(jié)果既可以定性，也可以定量；

2．檢測靈敏度高；

3．無需進行凝膠電泳實驗，節(jié)省實驗時間，提高了效率。

圖1 Taqman探針法工作原理

圖2 實時熒光定量PCR的幾個主要參數(shù)