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瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產物
發布時間：2021-11-01瀏覽次數：1130返回列表
一．原理
DNA片斷的分離與回收是基因工程操作中的一項重要技術，例如可收集特定酶切片斷用于克隆或制備探針，回收PCR產物用于再次鑒定等。回收實驗中兩個重要的技術指標是純度和回收率：前者未達標時會嚴重影響以后的酶切、連接、標記等酶參與的反應；后者不理想時往往會大大增加前期的工作量。
本實驗采用的是V-GENE公司的DNA凝膠回收試劑盒，其原理是：在凝膠融化液（Buffer DE-A）中凝膠塊被迅速融化并釋放出DNA。加入高離液序列溶液（Buffer DE-B）后DNA片斷被選擇性吸附到silica膜上。經Buffer W1、Buffer W2洗滌去除殘留在silica膜上的雜質和高濃度鹽離子后，吸附到 silica膜上的DNA片斷經微量水或Eluent洗脫下來，即可用于各種分子生物學實驗。
二．材料與方法
1 材料
PCR產物（未經純化）
2 儀器、用具
電泳儀、電泳槽、凝膠樣品梳、微波爐、臺式離心機、移液器、恒溫孵育器（55-65℃）、1.5ml 離心管
3 試劑
1×TAE電泳緩沖液；溴化乙錠溶液（EB）[有毒，小心操作] ；瓊脂糖；6×加樣緩沖液；NJ 緩沖液；DNA洗脫緩沖液；SPW洗滌緩沖液
2.4 方法
(1) 按常規方法于2%瓊脂糖凝膠進行電泳。
(2) 在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體。
(3) 稱量凝膠重量，以1mg=1μl換算凝膠體積。
(4) 加入3個凝膠體積的NJ緩沖液
(5) 懸浮均勻后于55℃-65℃加熱7min，期間每2—3min搖晃一次，直至凝膠塊完全融化。
(6) 把DNA—瓊脂糖溶液加到一個Mu-Pu DNA回收純化柱上，并把柱子裝在一干凈的2ml收集試管內，14000rpm離心1ml，棄去流出液。對于體積大于700μl 的樣品，則分別加到不同的柱子上，每次700μl。
(7) 用700μl無水乙醇稀釋的SPW洗滌緩沖液洗滌柱子，加入柱子中后靜置2-3min。室溫下14000rpm離心1min。
(8) 棄濾液，以同樣的方法再洗滌一次。
(9) 把柱子裝在一個滅菌干凈的1.5ml 離心管上，加入30-50μl的DNA洗脫緩沖液或無菌去離子水到柱基質上，14000rpm離心1min以洗脫出DNA。
(10) 取3μl樣品，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收結果。
注：PCR產物的純化選用直接純化法還是膠回收法主要取決于PCR產物。若PCR產物電泳時為單一條帶，可采用直接純化法，即將酶、dNTP等多余物質去掉便可；若PCR產物電泳時為多條帶，則要根據需要回收特定條帶，此時須選用膠回收法
