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膠回收和PCR產(chǎn)物回收技巧
發(fā)布時(shí)間：2021-08-06瀏覽次數(shù)：1048返回列表
1.提高膠回收量的技巧
1）增加電泳時(shí)的上樣量。
2） 電泳緩沖液用新鮮配制的。
3） 切膠時(shí)盡量只切有條帶的膠，減小切膠體積：含目的片斷很少的膠就不要要了，不然影響回收率。
4） 把切的兩塊或多塊膠融化后，無(wú)論多大的體積都用一個(gè)管子，轉(zhuǎn)移到同一個(gè)柱子上。
5） 溶膠時(shí)所加的溶液可多一點(diǎn)，這樣有利于DNA與膜的結(jié)合，不過一般不要多余750ul。
6） 膠回收的關(guān)鍵是通過柱子的溶液的鹽濃度、酸堿性(電荷)和疏水性使DNA與柱子結(jié)合，因此，若電泳緩沖液的PH偏高，可在溶膠液中加入10ul(PH 5.0，3mol/L的 NaAC);為了使DNA分子 好 的攔截在膜上，可以添加30%異丙醇在加熱溶解膠后的液體里。
7） 加洗脫液之前，將柱子在室溫放置幾分鐘(大約需10分鐘)，以使乙醇充分揮發(fā)。
8）后少加些洗脫液，盡量減少回收體積，一般用30-50μl洗脫液洗脫(不能太少，否則無(wú)法浸濕膜反而不利于洗脫);洗脫液滴在膜中央，以充分洗脫結(jié)合在 膜上的DNA。
9） 可以在加入洗脫液之后，可以在55度水浴5分鐘或放在50度水浴10分鐘以上再洗脫，或用封口膜密封4度過夜，第二天再離心回收，效果不錯(cuò)。
10）將離心后的洗脫液加回吸附柱，再次離心。
2. PCR 產(chǎn)物回收的詳細(xì)方法和步驟
1）普通膠回收
如果要膠回收，好還是用試劑盒，方便，回收率也略高，實(shí)在要手工回收，可以切膠后加入3倍體積TE，水浴熔化后，酚、酚/抽提干凈，乙醇沉淀 即可。
2）從低熔點(diǎn)凝膠回收DNA
純化DNA片段 加與凝膠體積相等的TE(10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA )，置65℃水浴5分鐘保溫，使凝膠完全溶解。待放至室溫，加等量酚(TE飽和，TE封在上層，取下層酚)，輕輕混勻(不用混 勻)，12000rpm，3分鐘離心。反復(fù)1-2次。取上層液，加0.1體積3mol/L醋酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積無(wú)水乙醇，進(jìn)行乙醇沉淀。將 純化的DNA加適量TE溶解，測(cè)定含量，備用(可用于目的基因結(jié)構(gòu)分析，探針 制備等)。
3）擴(kuò)增特異性好的PCR回收
如果PCR擴(kuò)增特異性好，只是簡(jiǎn)單的PCR產(chǎn)物純化回收，可以在PCR產(chǎn)物中加入50ug/ml 的蛋白酶K，37度1h，酚/抽提一次，抽提一次，上清加入0.1體積的醋酸鈉，2.5體積的無(wú)水乙醇沉淀回收
